Interaction entre protéines et acides nucléiques et régulation de l’expression des gènes - Archive ouverte HAL Accéder directement au contenu
Hdr Année : 2019

Interaction entre protéines et acides nucléiques et régulation de l’expression des gènes

Résumé

When I started my PhD, the yeast genome has just been published and more than half of yeast genes still had unknown functions. I participated to the functional analysis of factors involved in mRNA decay in Alain Jacquier’s laboratory. In particular, I characterized the role of Edc3, a new enhancer of decapping, involved in the regulation of RPS28B mRNA. In parallel I characterized several unknown H/ACA snoRNAs and also the first Cryptic Unstable transcripts (CUTs). Aside, I developed technological tools to improve synthetic lethal screens. During my post-doctoral fellowship in Timothy Hughes Laboratory, I worked on decoding the mouse “regulome”, i.e. the characterization of Mouse transcription factors DNA-binding motifs. I set up and orchestrated the project in mouse, and we could clone ~1200 DNA binding domains fused to the GST tag from the ~2000 mouse transcription factor we selected. Out of these clones, we have been able to purify ~800 proteins and identify ~600 DNA motifs, using the Protein Binding Microarray technology, in collaboration with Martha Bulyk’s laboratory at Harvard Medical School. A similar approach in yeast enabled us to identify 112 DNA binding motifs from the ~200 cloned yeast transcription factors. These resources constituted major advances in the knowledge of the regulatory regions recognized by transcription factors in both yeast and mouse genomes. Since 2008 when I came back in Alain Jacquier’s laboratory, I have been interested in a mechanism of transcriptional interference mediated by pervasive transcription, antisense of genes. In this work, we show that gene repression resulting from antisense transcriptional interference overlapping gene promoter constitutes a new mechanism of transcriptional regulation and concerns a large set of genes in yeast. This mechanism involve a combination of chromatin modifiers and can be reciprocal in many cases – which means that a gene repressed by antisense transcription can become itself a repressor of the antisense transcription in condition where it becomes expressed, such as in quiescence state. In parallel, I was interested in RNA-protein interactions characterization, and I implemented and improved the CRAC technic (UV Cross Linking and cDNA analysis) in the laboratory, in order to characterize RNA-binding specificities of cytoplasmic surveillance factors bound to rRNA, mRNA or ncRNA. This approach allowed me to characterize the targets of 5 rRNA binding factors, and I am now studying the RNA-binding specificities of several helicases involved in cytoplasmic surveillance pathways and capable to bind genome wide many RNA targets. I am also interested in the development of tools to distinguish sub- populations of RNA that we named “split CRAC”. Indeed, our laboratory expertise is protein complexes involved in cytoplasmic surveillance pathways and Micheline’s and Cosmin’s teams in the lab characterized key factors of the No Go Decay (NGD)/ Non Stop Decay (NSD) and the Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD) pathways. In the wave of this, I am interested in RNA- protein interactions related to these pathways, and in particular to the mode of action of certain helicases that belong to these processes. The first factor is a putative helicase that we named Tac4 for “translation associated factor 4” because we found it associated to the ribosomal small subunit. Preliminary data suggest that Tac4 could be involved in ribosome recycling when they are blocked in translation such as in NGD or NSD mechanisms. In collaboration with Micheline Fromont and Olivier Namy we aim to characterize the precise role of Tac4 in this recycling mechanism. The second factor is Ski2, the main SKI complex helicase, whose Micheline Fromont’s team in collaboration with Roland Beckman and Elena Conti, recently found that it could be associated to the ribosome to degrade coding segments of RNAs. In parallel, she observed that another form of the SKI complex could be involved in 3’ untranslated regions of RNA and comprises the Ska1 factor (for “SKI associated component”). The knowledge of Ska1 binding specificities should allow a better understanding of its precise role. The third factor is Upf1, the main helicase of the NMD mechanism. Cosmin Saveanu’s team has recently characterized two sub-complexes associated to Upf1: a “detector” complex (composed of Upf1, 2 and 3) and an “effector” complex (composed of Upf1 Nmd4, Ebs1 and the decapping machinery). In the aim to understand how Upf1 is associated to these two complexes, I realized preliminary experiments of RIP-seq and CRAC with Upf1, and started “split-CRAC” experiment with Upf1 and proteins of each sub-complexes. In the context of Lena Auderbert’s Master 2 internship we performed analysis of RIP and CRAC with Upf1, and preliminary results indicate that Upf1 preferentially bind 3’ UTR of mRNAs and 5’UTR in a lesser extend. Surprisingly, in addition to the expected NMD targets mRNAs, Upf1 is bound to an important number of “non-NMD” mRNA substrates. Lena started her PhD in September 2018 on this topic, and I am co-directing her thesis with Cosmin. Finally, using transcriptomic and biochemical technics, I am focusing on cytoplasmic surveillance pathways and in particular those involving Upf1, and on the understanding of mechanisms regulating subtle variations of poly(A) isoforms stability. Considering our converging interests and the complementarity of our expertise, joining Cosmin Saveanu’s team in September 2018 appeared as an evidence for me.
Au début de ma thèse, le génome de S. cerevisiae vient d’être publié et plus de la moitié des gènes de la levure ont des fonctions inconnues. J’ai participé à l’analyse fonctionnelle de facteurs impliqués dans le métabolisme des ARN dans le laboratoire d’Alain Jacquier. J’ai en particulier caractérisé le rôle d’Edc3, un activateur de decapping impliqué dans la régulation du messager du gène RPS28B. J’ai également caractérisé un certain nombre d’ARN non codants tels que des snoRNA à boite H/ACA ainsi que les premiers « Cryptic Unstable Transcripts ». En parallèle, j’ai participé au développement technologique d’outils pour pouvoir réaliser des cribles de létalité synthétique de manière plus performante chez la levure. Durant mon post-doctorat chez Timothy Hughes à Toronto, j’ai travaillé sur le déchiffrage du « regulome », c’est à dire l’identification des motifs reconnus par les facteurs de transcriptions. J’ai mis en œuvre et orchestré ce projet chez la souris, et nous avons pu cloner ≈ 1200 domaines de liaisons à l’ADN (DBD) des ≈ 2000 facteurs de transcription de souris en fusion avec la GST. Nous avons réussi à purifier de manière satisfaisante plus de 800 protéines et environ 600 motifs ont pu être caractérisés en réalisant des expériences de « Protein Binding Microarray » en collaboration avec Martha Bulyk à Harvard. Une approche similaire chez la levure nous a permis de caractériser 112 motifs de liaison à l’ADN parmi les ≈200 facteurs de transcription clonés. Ces ressources ont permis de faire une avancée majeure dans la connaissance des régions régulatrices des gènes qui sont reconnues par les facteurs de transcription dans ces espèces. Depuis 2008 et mon retour au laboratoire d’Alain Jacquier, je me suis intéressée à un mécanisme d’interférence transcriptionnelle induite par de la transcription pervasive en antisens des gènes. Dans cette étude nous montrons que la répression par interférence transcriptionnelle résultant de la transcription d’ARN antisens chevauchant le promoteur des gènes constitue un mécanisme de régulation qui concerne un grand nombre de gène chez la levure. Ce mécanisme d’interférence transcriptionnelle fait intervenir une combinaison de facteurs de modification de la chromatine et peut être réciproque dans beaucoup de cas, c’est à dire qu’un gène réprimé par la transcription d’un antisens pervasif peut devenir répresseur de la transcription pervasive en antisens quand il est exprimé, comme par exemple en quiescence. En parallèle, je me suis intéressée à la caractérisation des interactions ARN-protéines et j’ai implémenté au laboratoire et amélioré la technique du CRAC afin de caractériser les spécificités de reconnaissance de facteurs liant les ARN ribosomiques, ARNm et/ou ARNnc. Cette approche a permis de caractériser les cibles de 5 facteurs liant l’ARN ribosomique et je suis actuellement intéressée par certaines hélicases qui lient un grand nombre d’ARNm ou d’ARNnc dans l’ensemble du génome et qui sont impliquées dans des mécanismes de surveillance cytoplasmique. J’ai également participé au développement des outils qui permettent de distinguer les sous populations d’ARNs associés à des sous-complexes spécifiques. Notre laboratoire s’intéresse depuis plusieurs années aux complexes impliqués dans les mécanismes de surveillance cytoplasmique. En effet, les équipes du laboratoire ont caractérisé plusieurs des complexes associés aux mécanismes de contrôle qualité des ARNs. L’équipe de Micheline Fromont a participé à la découverte des facteurs clés du Non Stop Decay (NSD) et celle de Cosmin Saveanu a caractérisé récemment deux sous-complexes distincts associés à UPF1, l’hélicase majeure du Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD). Plus globalement, je m’intéresse aux interactions ARN-protéines dans les mécanismes de contrôle qualité des ARNs, qui impliquent généralement l’action d’hélicases particulières au sein de complexes ribonucléoprotéiques dont le rôle précis dans les mécanismes de contrôle qualité des ARN n’est pas bien compris à ce jour. Je propose d’essayer de répondre à cette question par des approches génomiques pour caractériser les spécificités de reconnaissance de certaines de ces hélicases au sein de leurs complexes protéiques respectifs, et d’essayer de comprendre les mécanismes mis en jeu au sein des sous-complexes. Pour cela, j’utilise une version améliorée du protocole du CRAC pour étudier des facteurs qui lient des ARN cellulaires modérément abondant. En couplant cette approche à des expériences de purifications biochimiques et de transcriptomique, nous disposons d’outils puisant pour l’analyse fonctionnelle de ces gènes. Le premier facteur en cours d’étude est l’hélicase putative que nous avons baptisée TAC4 (translation associated component 4) car il s’associe à la petite sous unité du ribosome. Les résultats préliminaires suggèrent que Tac4 pourrait intervenir dans le recyclage des ribosomes lorsque ceux-ci sont bloqués sur les ARNm lors des mécanismes de NGD (« No Go Decay ») ou de NSD. En collaboration avec Micheline Fromont et Olivier Namy, nous nous proposons de caractériser le rôle de Tac4 dans ce mécanisme de recyclage. Le deuxième facteur étudié est le gène SKI2 , l’hélicase majeure du complexe SKI, dont l’équipe de Micheline Fromont au laboratoire, en collaboration avec Roland Beckmann et Elena Conti, a récemment trouvé qu’il pouvait être associé au ribosome pour dégrader les parties traduites des ARNs. En parallèle, elle a aussi observé qu’une autre forme du complexe SKI mais incapable de s’associer au ribosome pouvait être impliquée dans la dégradation des régions non traduites des ARNm, et que ce sous complexes fait intervenir la protéine baptisée Ska1 (Ski associated component 1). Connaître les spécificités de reconnaissance des différents sous-complexes associés au complexe SKI devrait permettre de mieux comprendre le rôle de Ska1. Enfin, le troisième facteur est Upf1, l’hélicase majeure du NMD, qui est trouvé dans deux sous-complexes : un complexe « détecteur » et un complexe « effecteur ». Afin d’essayer de comprendre de quelle manière Upf1 est associé à ces deux sous complexes, j’ai réalisé des expériences préliminaires de RIPseq et de CRAC avec Upf1 et démarré, à l’occasion de l’encadrement de Léna Audebert lors de son stage de Master 2, des expériences de « split-CRAC » (ou les deux étiquettes utilisées sont sur des protéines différentes ce qui permet de sélectionner des sous complexes) dans plusieurs contextes associés à Upf1. Les résultats préliminaires indiquent qu’Upf1 se lie préférentiellement dans les 3’UTR des transcrits et de façon plus modérée aux extrémités 5’. De manière très surprenante, en plus de trouver les cibles attendues du NMD, Upf1 se lie à un grand nombre de transcrits « non-NMD », et Léna Audebert a commencé en octobre 2018 une thèse que je co-dirige avec Cosmin Saveanu et dont le sujet consiste à comprendre le rôle joué par Upf1 et ses partenaires dans la régulation post- transcriptionnelle de ces substrats. Précisément, je concentre donc actuellement mon intérêt principalement sur la compréhension des mécanismes qui régulent les variations subtiles de stabilité des différentes isoformes des queues poly(A) des transcrits en utilisant des approches transcriptomiques et biochimiques. Compte tenu de la convergence de nos sujets de recherche et de la complémentarité de nos expertises, j’ai naturellement rejoint en septembre 2018 le groupe de Cosmin Saveanu.
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Identifiants

  • HAL Id : tel-04048246 , version 1

Citer

Gwenaël Badis. Interaction entre protéines et acides nucléiques et régulation de l’expression des gènes. Génomique, Transcriptomique et Protéomique [q-bio.GN]. Sorbonne Université, 2019. ⟨tel-04048246⟩
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