Proteomics analysis of aging proteins - Archive ouverte HAL Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2023

Proteomická analýza stárnoucích proteinů

Proteomics analysis of aging proteins

Analyse protéomique des protéines durant le vieillissement

Résumé

Analýza a charakterizace stárnutí a archeologických proteinů patří mezi nejnovější výzvy v analytické chemii. Byly vyvinuty různé techniky pro analýzu současných proteinů, ale nebyly plně aplikovány na stárnoucí proteiny. To přispívá k nedostatku znalostí týkajících se mechanismu stárnutí proteinů. Kromě toho analýza archeologických proteinů, které jsou mnohem méně studovány než starobylá DNA, ale jsou odolnější vůči degradačním procesům, je slibným kandidátem pro archeologický i forenzní výzkumu. V první části této disertační práce byly studovány stárnoucí proteiny pomocí LC-MS. Byly studovány účinky stárnutí na proteinové sekvence, včetně racemizace aminokyselin, posttranslačních modifikací a degradace proteinů. K tomuto účelu byly použity kolageny z různých organismů různého stáří. Pro stanovení přesné rychlosti racemizace aminokyselin byly použity podmínky hydrolýzy proteinu v prostředí deuteria k vyloučení přirozené racemizace během hydrolýzy. Následně byla vyvinuta metoda chirální separace pro stanovení poměrů aminokyselinových enantiomerů. Výsledky ukázaly, že tyto poměry byly v závislosti na věku progresivní u D-aminokyselin. Vývoj posttranslačních modifikací byl také progresivní s věkem a je primární teorií, která vysvětluje redukci proteolýzy a zvýšení hydrofobicity stárnutí proteinů. Navíc srovnání mapování peptidů kolagenů v různých věkových věcích ukázalo, že při stárnutí dochází k degradaci přirozené sekvence během stárnutí a způsobuje ztrátu jedné pětiny informací o proteinové sekvenci. Ve druhé části této disertační teze byly archeologické proteiny studovány pomocí NanoLC-MS. Proteomika, v tomto případě zvaná paleoproteomika, může být aplikována na starobylé vzorky pro archeologický, antropologický a forenzní výzkum. Odhad pohlaví je zásadní pro charakterizaci kosterních pozůstatků, protože je to první krok v lidské identifikaci. Osteoarchaeologie a genomika jsou tradiční metody používané pro tento odhad, mají však omezení a nejsou absolutní. V této studii byla paleoproteomika vyvinuta jako alternativní metoda. Na základě dvou forem proteinu amelogenin, který je pohlavně rozdílný, konzervovaných v zubech, byly oba pohlaví rozlišeny metodou nanoLC-MS na základě rozdílů v jejich proteogenních sekvencích. Tato metoda je spolehlivější a méně omezující než předchozí metody. Protože zuby jsou jako archeologické vzorky vzácné a cenné, jen málokdy jsou k dispozici pro destruktivní biologické a chemické analýzy. Vyvinutý proteomický přístup byl navržen tak, aby byl minimálně invazivní. To bylo potvrzeno skenováním zubů před a po extrakci amelogeninu pomocí skenovacího elektronového mikroskopu a mikropočítačové tomografie.
The analysis and characterization of aging and archaeological proteins are among the latest challenges in analytical chemistry. Different techniques have been developed to analyze recent proteins but have not been fully applied to aging proteins. This contributes to the lack of knowledge regarding the aging mechanism of proteins. In addition, the analysis of archaeological proteins, which are much less studied than ancient DNA but more resistant to degradation processes, is a promising candidate for archeological as well as forensic research. In the first part of this dissertation thesis, aging proteins were studied using LC-MS. The effects of aging on protein sequences, including amino acid racemization, post-translational modifications, and protein degradation, were studied. Collagens from different organisms of different ages were used for this purpose. To determine the exact rate of amino acid racemization, protein hydrolysis conditions were used in a deuterium environment to exclude natural racemization during hydrolysis. Subsequently, a chiral separation method was developed to determine the amino acid enantiomer rates. The results showed that these rates were progressive in the D-form of amino acids, according to age. The evolution of post-translational modifications was also progressive with age and is the primary theory to explain the reduction of proteolysis and increases the hydrophobicity of aging proteins. Furthermore, peptide mapping comparison of collagens at different ages showed that natural sequence degradation occurs during aging and causes a loss of one-fifth of the protein sequence information. In the second part of this dissertation thesis, archaeological proteins were studied using nanoLC-MS. Proteomics, called paleoproteomics in this case, can be applied to ancient samples for archaeological, anthropological, and forensic research. Sex estimation is fundamental for the characterization of skeletal remains as it is the first step in human identification. Osteoarchaeology and genomics are the traditional methods used for this estimation; however, they have limitations and are not absolute. In this study, paleoproteomics was developed as an alternative method. Based on two sex-dependent forms of amelogenin protein preserved in teeth, both biological sexes were distinguished by nanoLC-MS because of differences in their proteogenic sequences. This method is more reliable, and less restrictive than previous methods. As teeth remains as archaeological samples are rare and valuable, few are available for destructive biological and chemical analyses. The developed proteomic approach was designed to be minimally-invasive. This was confirmed by scanning the teeth before and after amelogenin extraction using both scanning electron microscope and micro-computed tomography.
L'analyse et la caractérisation des protéines durant le vieillissement et archéologiques constituent des défis récents en chimie analytique. Bien que différentes techniques aient été développées pour analyser les protéines récentes, elles n'ont pas encore été complètement appliquées aux protéines durant le vieillissement. Ce manque de recherche contribue à une lacune de connaissances concernant les mécanismes du vieillissement des protéines. En outre, l'analyse des protéines archéologiques, bien qu'elles soient moins étudiées que l'ADN ancien, présente un niveau de conservation supérieur et constitue donc d'excellentes candidates pour contribuer à la recherche archéologique et médico-légale. Dans la première partie de cette thèse de doctorat, une étude des protéines durant le processus de vieillissement a été réalisée par LC-MS. Les effets du vieillissement sur la séquence protéique, y compris la racémisation des acides aminés, les modifications post-traductionnelles et la dégradation des protéines, ont été examinés. Des échantillons de collagène provenant d'organismes et d'âges différents ont été utilisés à cette fin. Pour déterminer précisément le taux de racémisation des acides aminés, l'hydrolyse des protéines a été réalisée dans un milieu deutéré pour empêcher la racémisation naturelle pendant le processus d'hydrolyse. Une méthode de séparation chirale a ensuite été développée pour évaluer les ratios énantiomériques des acides aminés. Les résultats ont révélé que ces ratios augmentaient progressivement pour la forme D des acides aminés en fonction de l'âge. L'évolution des modifications post-traductionnelles a également montré une progression avec l'âge, ce qui pourrait expliquer la réduction de la protéolyse et l'augmentation de l'hydrophobicité des protéines durant le vieillissement. De plus, la comparaison de la cartographie peptidique du collagène à différents âges a révélé une dégradation naturelle de sa séquence au fil du vieillissement, entraînant une perte d'environ un cinquième de son information. Dans la deuxième partie de cette thèse de doctorat, une étude a été menée sur les protéines archéologiques en utilisant la nanoLC-MS. La paléoprotéomique, une branche de la protéomique adaptée aux échantillons anciens, a été appliquée dans le contexte de la recherche archéologique, anthropologique et médico-légale. L'estimation du sexe est d’une importance fondamentale dans la caractérisation des restes squelettiques, car elle constitue la première étape de l'identification humaine. Les méthodes traditionnelles telles que l'ostéoarchéologie et la génomique sont couramment utilisées pour cette estimation, mais elles présentent des limites et ne sont pas infaillibles. Dans cette étude, la paléoprotéomique a été développée comme une méthode alternative. Grâce à l'analyse par nanoLC-MS, deux formes de protéines d'amélogénine conservées dans les dents et variant en fonction du sexe biologique, ont été identifiées en raison de leurs différences au niveau de leurs séquences protéiques. Cette méthode est plus fiable et moins contraignante que les méthodes précédentes. Étant donné que les restes dentaires, en tant qu'échantillons archéologiques, sont rares et précieux, seuls quelques-uns d'entre eux sont disponibles pour des analyses biologiques et chimiques destructives. L'approche protéomique développée dans cette étude a été conçue pour être peu invasive. Cette caractéristique a été confirmée par l'analyse des dents avant et après l'extraction de l'amélogénine à l'aide d'un microscope électronique à balayage et d'une microtomographie assistée par ordinateur.
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Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)

Dates et versions

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  • HAL Id : tel-04290299 , version 1

Citer

Marine Morvan. Proteomics analysis of aging proteins. Analytical chemistry. Univerzita Pardubice, 2023. English. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-04290299⟩
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