Monooxygénations catalysées par des polycétide synthases modulaires : caractérisation structurale et fonctionnelle - IMoPA - Ingénierie Moléculaire, Cellulaire et Physiopathologie Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2023

Monooxygenations catalyzed by modular polyketide synthases : structure-function relationships

Monooxygénations catalysées par des polycétide synthases modulaires : caractérisation structurale et fonctionnelle

Résumé

Polyketides are specialized metabolites synthetized by a wide range of organisms, including bacteria, fungi, plants, and some animals. Although their ecological functions remain poorly understood, their biological activities allow them to be exploited as drugs in humans and animals (as e.g. antibiotics, anthelmintics, anticancer agents, etc.). While in some cases the natural molecules can be utilized, in others it is necessary to adapt the structures of the metabolites to optimize their medicinal properties. A promising strategy for obtaining such molecules is to modify the polyketide synthase (PKS) enzymes by genetic engineering. However, this approach requires detailed knowledge of how these enzymes function on the molecular level. PKSs are complex high-molecular-weight systems divided into several polypeptides called subunits, which are themselves composed of modules, each catalyzing a cycle of polyketide extension and modification. The activities of these modules are divided into domains, each with a defined biosynthetic role.The discovery of new enzymatic functions carried by these domains extends the known range of reactions catalyzed by PKSs and, consequently, the chemical diversity of the polyketides synthesized. In principal, these activities can then be incorporated into other PKSs, leading to the synthesis of polyketide derivatives with potentially improved properties. Several non-canonical reactions of interest have recently been identified in the PKSs synthesizing oocydine and lobatamide A catalyzed by various monooxygenase activities. Specifically, three types of monooxygenases were identified: Baeyer-Villiger type monooxygenases (BVMOs), -hydroxylases and oxime-generating monooxygenases (Ox).In order to underpin efforts to exploit this chemistry in engineering, the work describes in this thesis aimed to establish detailed structure-function relationships for these enzymes. The principal achievement of this PhD was to characterize in detail the Ox domain of the lobatamide PKS using an approach combining X-ray crystallography and site-directed mutagenesis coupled with mass spectrometry. Its three-dimensional structure was elucidated at high resolution and the amino acids involved in enzymatic catalysis were identified, allowing us to propose a catalytic mechanism. In addition, in silico docking and mutagenesis experiments provided further information on the order of biosynthetic events within the module and its spatial arrangement during catalysis. The results of this portion of the work were published in the high-impact journal Angew. Chemie as a full article.Preliminary bioinformatics studies, followed by the production and purification of the BVMOs and -hydroxylase, enabled us to initiate the first crystallisation trials of these enzymes, with the aim of solving their structures and establishing the structural basis of these monooxygenase activities. These attempts were not successful, but follow-up experiments are proposed.
Les polycétides sont des métabolites spécialisés synthétisés par une grande variété d’organismes incluant les bactéries, les champignons, les végétaux ou encore certains animaux. Bien que leurs fonctions écologiques demeurent souvent mystérieuses, leurs activités biologiques leur permettent d'être exploitées comme médicaments chez l'homme et l'animal (antibiotiques, anthelmintiques, anticancéreux, etc.). Si, dans certains cas, les molécules naturelles peuvent être utilisées, dans d'autres, il est nécessaire d'adapter les structures des métabolites pour optimiser leurs propriétés médicinales. Une stratégie prometteuse pour obtenir de telles molécules consiste à modifier les enzymes polykétides synthases (PKS) par génie génétique. Cependant, cette approche nécessite une connaissance détaillée du fonctionnement de ces enzymes au niveau moléculaire. Les PKS sont des systèmes complexes de haut poids moléculaire divisés en plusieurs polypeptides appelés sous-unités, eux-mêmes composés de modules, chacun catalysant un cycle d'extension et de modification des polykétides. Les activités de ces modules sont divisées en domaines, chacun ayant un rôle biosynthétique défini.La découverte de nouvelles fonctions enzymatiques portées par ces domaines élargit la gamme connue des réactions catalysées par les PKS et, par conséquent, la diversité chimique des polykétides synthétisés. En principe, ces activités peuvent ensuite être incorporées dans d'autres PKS, conduisant à la synthèse de dérivés de polykétides aux propriétés potentiellement améliorées. Plusieurs réactions non canoniques intéressantes ont été récemment identifiées dans les PKS synthétisant l'oocydine et le lobatamide A, catalysées par diverses activités monooxygénases. Plus précisément, trois types de monooxygénases ont été identifiés : les monooxygénases de type Baeyer-Villiger (BVMO), les -hydroxylases et les monooxygénases génératrices d'oxime (Ox).Afin d'étayer les efforts visant à exploiter cette chimie dans l'ingénierie, le travail décrit dans cette thèse visait à établir des relations structure-fonction détaillées pour ces enzymes. Le principal accomplissement de ce doctorat a été de caractériser en détail le domaine Ox de la PKS de la lobatamide en utilisant une approche combinant la cristallographie aux rayons X et la mutagénèse dirigée, couplée à la spectrométrie de masse. Sa structure tridimensionnelle a été élucidée à haute résolution et les acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique ont été identifiés, ce qui nous a permis de proposer un mécanisme catalytique. De plus, des expériences de docking in silico et de mutagenèse ont fourni des informations supplémentaires sur l'ordre des événements biosynthétiques au sein du module et sur son agencement spatiale au cours de la catalyse. Les résultats de cette partie du travail ont été publiés dans la revue à fort impact Angew. Chemie en tant qu'article complet.Des études bioinformatiques préliminaires, suivies de la production et de la purification des BVMO et de l’-hydroxylase, nous ont permis d’initier les premiers essais de cristallisation de ces enzymes, dans le but de résoudre leurs structures et d'établir les bases structurales de ces activités monooxygénases. Ces tentatives n'ont pas été couronnées de succès, mais des expériences supplémentaires sont proposées.
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Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04585012 , version 1 (23-05-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04585012 , version 1

Citer

Romain Francois. Monooxygénations catalysées par des polycétide synthases modulaires : caractérisation structurale et fonctionnelle. Biochimie, Biologie Moléculaire. Université de Lorraine, 2023. Français. ⟨NNT : 2023LORR0259⟩. ⟨tel-04585012⟩
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