Conformation studies of two ribosomal RNAs : 16S RNA from E.coli and 5S RNA from Xenopus laevis : structure-function relationships.
Etude de la conformation de deux ARN ribosomiques : l'ARN 16S d'Escherichia coli et l'ARN 5S de Xenopus laevis. Relations structure-fonction.
Résumé
This thesis focuses on the study of the conformation of two ribosomal RNAs: the 16S rRNA from Escherichia coli and the 5S rRNA from Xenopus laevis oocytes. A systematic study was carried out on the entire 16S RNA molecule in its isolated form, within the 30S subunit, and in the 70S ribosome, using enzymatic and chemical structure-specific probes. These studies make it possible to identify regions in contact with proteins, those located at the interface between the two ribosomal subunits, and those undergoing conformational adjustments. The analysis of a region involved in mRNA decoding, in the presence of tRNA bound to the A and P sites of the ribosome, allowed us to identify functional regions involved in tRNA binding, as well as conformational changes induced by this binding. In immature Xenopus oocytes, 5S RNA is associated with a protein, TFIIIA, which also binds to the 5S RNA gene to initiate its transcription. We studied the RNA elements important for the interaction with TFIIIA. Individual deletions, through site-directed mutagenesis, of bulged nucleotides in the RNA and the corresponding nucleotides in the DNA showed that the elements required for TFIIIA binding to DNA and RNA are likely different. Similarly, point mutations introduced at the hinge between the three helical domains of 5S RNA further supported the idea of its crucial role in determining the tertiary structure of 5S RNA, necessary for TFIIIA recognition. The study of the conformation of various RNA mutants using structure-specific probes confirmed the proposed model of the 5S RNA tertiary structure. The use of a reversible RNA-protein crosslinking reagent allowed us to define the topography of the 5S RNA–TFIIIA complex.
Ce mémoire porte sur l'étude de la conformation de deux ARN ribosomiques, l'ARN 16S d'Escherichia coli et l'ARN 5S d'oocyte de Xenopus laevis. Une étude systématique a été réalisée sur toute la molécule d'ARN 16S isolée, dans la sous-unité 30S et dans le ribosome 70S à l'aide de sondes de structure enzymatiques et chimiques. Ces études permettent de définir les régions en contact avec les protéines, celles situées à l'interface des deux sous-unités et celles subissant des ajustements conformationnels. L'étude d'une région possédant un rôle dans le décodage de l'ARNm, en présence de l'ARNt fixé aux sites A et P du ribosome nous a permis de dégager les régions fonctionnelles impliquées dans la fixation de l'ARNt ainsi que les changements conformationnels induits par cette fixation. Dans les oocytes immatures de Xenope, l'ARN 5S est associé à une protéine, TFIIIA qui se fixe également au gène de l'ARN 5S pour en initier la synthèse. Nous avons étudié les éléments de l'ARN, importants dans l'interaction avec TFIIIA. La délétion individuelle, par mutagenèse dirigée, des nucléotides en bulge de l'ARN et des nucléotides correspondants dans l'ADN, montre que les éléments requis pour la fixation de TFIIIA sur l'ADN et sur l'ARN sont certainement différents. De même, des mutations ponctuelles introduites à la charnière des 3 domaines hélicoïdaux de l'ARN 5S nous ont permis de conforter l'idée du rôle crucial de celle-ci dans la détermination de la structure tertiaire de l'ARN 5S, nécessaire à la reconnaissance de TFIIIA. L'étude de la conformation de différents ARN mutants par l'utilisation de sondes de structure permet de confirmer le modèle de structure tertiaire proposé pour l'ARN 5S. L'utilisation d'un réactif de pontage réversible ARN-protéine nous a permis de définir la topographie du complexe ARN 5S-TFIIIA.