Biochemical and structural study of the plant PRC2 complex and ULTRAPETALA1, two antagonistic regulators of chromatin in Arabidopsis thaliana
Étude biochimique et structurale du complexe PRC2 et de la protéine ULTRAPETALA1, deux régulateurs antagonistes de la chromatine chez Arabidopsis thaliana
Résumé
The development of multicellular organisms such as the model plant Arabidopsis thaliana relies on epigenetic factors that govern chromatin dynamics and regulate the transcription of specific genes by either repressing or activating them. Two groups of proteins function antagonistically in these regulations: the Polycomb group (PcG) and the Trithorax group (TrxG).The Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) plays a crucial role in maintaining thousands of genes in a repressed state by depositing methylation marks on lysine 27 of histone 3 (H3K27me3). Conversely, proteins from the TrxG specifically counteract repression mediated by the PcG group, particularly on common gene targets. Although the PcG and TrxG proteins are progressively being identified and characterized, the molecular mechanisms that govern the transition of a gene from a PcG-repressed state to a TrxG-activated state remain poorly understood. In Arabidopsis, the ULTRAPETALA1 (ULT1) protein acts as an antagonist to the PRC2 complex, contributing to the conversion of an inactive state of PRC2 target genes into active state. Furthermore, in vivo interaction analyses (Y2H, BiFC, and IP-MS) have revealed that ULT1 interacts with the CLF and SWN methyltransferases of the PRC2 complexes. These observations indicate that ULT1 might directly disrupt the function of these complexes. However, the lack of biochemical and structural data on these proteins makes the study of their function challenging.This PhD project aims to gain a better understanding of ULT1 and PRC2 antagonistic function using a structural biology and biochemistry approach. To achieve this, I characterized the ULT1 protein and the PRC2 complex from Arabidopsis in vitro, uncovering the molecular details of their interaction.In the first section, dedicated to the biochemical characterization of the ULT1 protein, I successfully identified two structured domains after optimizing their expression and purification conditions. The resolution of the C-terminal domain of ULT1 by X-ray crystallography revealed an atypical CW domain that may recognize modifications on H3K36.In the second part dedicated to the in vitro characterization of the interaction between ULT1 and PRC2 complexes, I demonstrated a physical interaction between ULT1 and the complex containing the methyltransferase SWN (PRC2-SWN complex). I also showed that this interaction was stable and that ULT1 binding did not dissociate the PRC2-SWN complex. Finally, a Cryo-EM study of the ULT1 and PRC2-SWN complex did not reveal density corresponding to ULT1, indicating that it might bind to a flexible region of the PRC2-SWN complex.In conclusion, this PhD work enabled the development of essential tools and methods for in vitro study of ULT1 and PRC2 complexes in Arabidopsis, while also bringing new insights into the function of ULT1 and its antagonism with the PRC2-SWN complex. These findings direct our research toward a more precise characterization of the mechanisms that govern transition of chromatin from a repressed to an active state.
Le développement des organismes multicellulaires tels que la plante modèle Arabidopsis thaliana dépend de facteurs épigénétiques qui contrôlent la dynamique de la chromatine et régulent la transcription de gènes spécifiques en la réprimant ou l’activant. Parmi les acteurs impliqués dans ces régulations, deux groupes de protéines fonctionnent de manière antagoniste : le groupe Polycomb (PcG) et le groupe Trithorax (TrxG).Le Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) joue un rôle essentiel dans le maintien de milliers de gènes à l’état réprimé, par la déposition de marques de méthylation sur la lysine 27 de l’histone 3 (H3K27me3). A l’inverse, les protéines du groupe Trithorax contrecarrent spécifiquement la répression médiée par le groupe Polycomb, sur des cibles géniques communes. Alors que les protéines des groupes PcG et TrxG sont de mieux en mieux identifiées et caractérisées, les mécanismes moléculaires qui permettent de commuter un gène d’un état réprimé par PcG vers un état activé par TrxG sont encore peu connus. Chez Arabidopsis, la protéine ULTRAPETALA1 (ULT1), fonctionne comme un antagoniste du complexe PRC2, participant à la commutation de gènes cibles de PRC2 vers un état actif. De plus, des analyses d’interaction in vivo (Y2H, BiFC et IP-MS) ont révélé qu’ULT1 interagit avec les méthyltransférases CLF ou SWN des complexes PRC2. Ces observations indiquent qu’ULT1 pourrait directement perturber la fonction de ces complexes. Cependant, l’absence de donnée biochimique et structurale sur ces protéines rend l’étude de leur fonction difficile.Le projet de thèse vise, par une approche de biologie structurale et de biochimie, à mieux comprendre les mécanismes de leur fonction antagoniste. Pour ceci, j’ai caractérisé in vitro la protéine ULT1 et le complexe PRC2 d’Arabidopsis, dans le but de mettre en évidence les détails moléculaires de leur interaction.Dans une première partie concernant la caractérisation biochimique de la protéine ULT1, j’ai pu, après mise au point de ses conditions d’expression et de purification, y identifier deux domaines structurés. La résolution du domaine C-Terminal d’ULT1 par cristallographie aux rayons X a révélé un domaine CW atypique qui pourrait reconnaitre des modifications sur H3K36.Dans une deuxième partie concernant la caractérisation in vitro de l’interaction entre ULT1 et les complexes PRC2, j’ai pu révéler une interaction physique entre ULT1 et le complexe contenant la méthyltransférase SWN (complexe PRC2-SWN). J’ai également démontré que cette interaction était stable et que la liaison d’ULT1 ne dissociait pas le complexe PRC2-SWN. Enfin, une étude par Cryo-EM du complexe composé d’ULT1 et PRC2-SWN n’a pas révélé de densité correspondant à ULT1, indiquant qu’elle pourrait se lier à une région flexible du complexe PRC2-SWN.En conclusion, cette thèse a permis de développer des outils et méthodes essentiels à l’étude in vitro d’ULT1 et des complexes PRC2 chez Arabidopsis, et apporte également de nouvelles pistes de réflexion concernant la fonction d’ULT1 et son antagonisme avec le complexe PRC2-SWN. Ces résultats nous permettent d’orienter nos recherches pour une caractérisation plus précise des mécanismes de commutation de la chromatine d’un état réprimé à actif.
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