Discovery of new glycoside-phosphorylases for oligosaccharide synthesis
Découverte de nouvelles glycoside-phosphorylases pour la synthèse d'oligosaccharides
Résumé
Glycoside-phosphorylases are particular carbohydrate active enzymes (CAZymes), able to catalyze both glycoside degradation by using inorganic phosphate to breakdown osidic linkages, and synthesis by using sugar-phosphates as glycosyl donors. Very few glycoside-phosphorylases have been characterized to date compared to the other CAZymes, despite their involvement in important biological processes, in particular in the gut of mammals, and their potential for the synthesis of high-added value glycosides. In genomes and metagenomes, their sequences are indeed difficult to discriminate from those of glycoside-hydrolases and transferases, with which they share many structural and mechanistic similarities. Many glycoside-phosphorylases are thus probably still hidden in the uncultured fraction of microbial ecosystems.In this thesis work, we developed a novel approach to boost the discovery of glycoside-phosphorylases, and to analyze their diversity in microbiomes. This generic approach combines sequence-based mining of (meta)genomes and activity-based screening of GP activity. To establish the proof of concept, we first targeted the CAZy family GH130, which contains both mannoside-phosphorylases and mannosidases targeting mannosides of various structures and origins. We analyzed 6,308 GH130 sequences, including 4,714 from the human, bovine, porcine and murine microbiomes. Using sequence similarity networks, we divided the diversity of sequences into 15 mostly isofunctional meta-nodes; of these, nine contained no experimentally characterized member. By examining the multiple sequence alignments in each meta-node, we predicted the determinants of the phosphorolytic mechanism and linkage specificity. These predictions were tested by characterizing four members of this family, of which the sequences are among the most prevalent and abundant GH130 sequences of the human gut microbiome. Their functions were proven by using chromogenic assays, high-performance anion exchange chromatography, nuclear magnetic resonance and cyclic ion mobility mass spectrometry. We discovered the first known 1,4-mannosyl-glucuronicacid phosphorylase, and a very original dual mannoside-phosphorylase/transmannosylase. Both of them target glycosidic motifs found in pathogenic yeasts and bacteria. This approach was then applied to the analysis of families GH65, GH94, GH112, GH149 and GH161. We showed that the sequence and functional diversity of the GH65, GH94 and GH112 families is already well covered by the presently available genomic and biochemical data. In contrast, the GH149 and GH161 sequences, in particular the metagenomic ones, are probably a source of functional novelty. In total, eleven targets were selected from uncharacterized meta-nodes, representing, potentially, eleven novel functions, or at least functions which are not described for these families. In this thesis work, we thus developed an efficient strategy for the discovery of glycoside-phosphorylases and assessment of their diversity in microbiomes. It also revealed possible interactions between gut bacteria, and allowed us to identify novel biotechnological tools for the synthesis of antigenic oligosaccharides.
Les glycoside-phosphorylases sont des enzymes actives sur les hydrates de carbone (CAZymes), capables de catalyser à la fois la dégradation des glycosides en utilisant le phosphate inorganique pour rompre les liaisons osidiques, et leur synthèse en utilisant les sucre-phosphates comme donneurs de glycosyles. Très peu de glycoside-phosphorylases ont été caractérisées à ce jour par rapport aux autres CAZymes, malgré leur implication dans d'importants processus biologiques, en particulier dans le système digestif des mammifères, et leur potentiel pour la synthèse de glycosides à haute valeur ajoutée. Dans les génomes et les métagénomes, leurs séquences sont en effet difficiles à distinguer de celles des glycosides-hydrolases et des transférases, avec lesquelles elles partagent de nombreuses similitudes structurales et mécanistiques. De nombreuses glycoside-phosphorylases sont donc probablement encore cachées dans la fraction non cultivée des écosystèmes microbiens.Dans ce travail de thèse, nous avons développé une nouvelle approche pour accélérer la découverte de glycoside-phosphorylases, et pour analyser leur diversité dans les microbiomes. Cette approche générique combine l’exploration de larges espaces de séquences (méta)génomiques, et le criblage d’activités glycoside-phosphorylases. Pour établir la preuve du concept, nous avons d'abord ciblé la famille CAZy GH130, qui contient à la fois des mannoside-phosphorylases et des mannosidases ciblant des mannosides de structures et d'origines diverses. Nous avons analysé 6 308 séquences GH130, dont 4 714 provenant des microbiomes humains, bovins, porcins et murins. En utilisant des réseaux de similarité de séquences, nous avons divisé la diversité des séquences en 15 groupes principalement isofonctionnels ; parmi ceux-ci, neuf ne contenaient aucun membre caractérisé expérimentalement. En analysant les alignements de séquences pour chaque groupe, nous avons pu prédire les déterminants du mécanisme phosphorolytique et de la spécificité de liaison osidique. Ces prédictions ont été testées en caractérisant quatre membres de cette famille, dont les séquences sont parmi les séquences GH130 les plus répandues et les plus abondantes dans le métagénome intestinal humain. Leurs fonctions précises ont été identifiées grâce à une combinaison d’analyses chromogéniques, chromatographiques, de résonance magnétique nucléaire, de spectrométrie de masse et mobilité ionique. Nous avons découvert la première -1,4-mannosyl-acide glucuronique-phosphorylase connue, et une mannoside-phosphorylase/transmannosylase très originale. Toutes deux ciblent des motifs glycosidiques trouvés dans des levures et bactéries pathogènes. Cette approche a ensuite été appliquée à l'analyse des familles GH65, GH94, GH112, GH149 et GH161. Nous avons montré que la diversité de séquences et de fonctions des familles GH65, GH94 et GH112 est déjà bien couverte par les données génomiques et biochimiques actuellement disponibles. En revanche, les séquences GH149 et GH161, en particulier issues des métagénomes, sont probablement une source de nouveauté fonctionnelle. Au total, onze cibles ont été sélectionnées à partir de groupes de séquences non caractérisés, représentant, potentiellement, onze nouvelles fonctions, ou du moins des fonctions qui ne sont pas décrites pour ces familles. Ce travail de thèse a ainsi permis de développer une stratégie efficace pour la découverte de nouvelles glycoside-phosphorylases et l'évaluation de leur diversité dans les microbiomes. Il a également révélé des interactions possibles entre les bactéries intestinales, et permis d’identifier de nouveaux outils biotechnologiques pour la synthèse d'oligosaccharides antigéniques.
| Origine | Fichiers produits par l'(les) auteur(s) |
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