Activite transcriptionnelle aux stades precoces de l'embryogenese : etude systematique par mutagenese de la region regulatrice du virus polyome - Archive ouverte HAL
Theses Year : 1993

Transcriptional activity at the early embryonic stage: a systematic study of the polyoma enhancer by mutagenesis

Activite transcriptionnelle aux stades precoces de l'embryogenese : etude systematique par mutagenese de la region regulatrice du virus polyome

Abstract

The permissiveness of Polyoma virus depends on the cell expression of a network of transcriptional factors. Embryonal carcinoma cells such as PCC4 and F9, which are representatives of early embryonic stages, are not permissive to infection by the virus. All Polyoma mutants isolated from these cells show alterations in a region of the viral genome important for early and late transcription (which has been defined as an enhancer), as well as for replication. In order to determine the molecular mechanisms involved in the regulation of early viral transcription in different cell types, we set out to characterize the role of each sub-sequence of the Polyome virus enhancer region. Systematic mutagenesis using directed deletions, internal deletions, targeted and directed mutagenesis was carried out in vitro. The effects of the various mutated regions on the activity of the early viral promoter placed upstream of a luciferase reporter gene were tested after transfection in three permissive and non-permissive cell lines: NIH-3T3, F9 and PCC4. Site-specific oligonucleotide constructs were also used to determine the function and localization of specific transcription factors in each cell type. The results revealed regions important for transcriptional activity, where no protein interactions had previously been described. They enabled the identification of regions targeted for inhibitory effects in embryonal carcinoma cells, and revealed that these effects mask activating effects. These were unexpectedly exerted mainly via the PEA1/AP1 site in F9 cells.
Le virus Polyome constitue un modèle d'organisme dont l'expression depend du réseau de facteurs transcriptionnels present dans les cellules qu'il infecte. Les cellules de carcinome embryonnaire telles que les PCC4 et les F9 qui sont representatives de stades précoces embryonnaires, ne sont pas permissives à l'infection par le virus. Tous les mutants de Polyome isolés sur ces cellules présentent des remaniements dans une region du genome viral importante pour la transcription précoce et tardive (qui a été définie comme enhancer), ainsi que pour la replication. Afin de determiner les mécanismes moléculaires impliqués dans la regulation de la transcription virale précoce dans différents types cellulaires, nous avons entrepris de caractériser le role de chaque sous-sequence de la région enhancer du virus Polyome. Une mutagénèse systématique par délétions orientées, délétions internes, mutagénèse ciblée et dirigée, a été réalisée in vitro. Les effets des différentes regions mutées sur l'activité du promoteur viral précoce place en amont d'un gene rapporteur luciférase ont été testes après transfection dans trois lignées de cellules permissives ou non: NIH-3T3, F9 et PCC4. Des constructions utilisant des oligonucleotides portant des sites particuliers ont d'autre part été réalisées pour preciser la fonction et la localisation de certains facteurs de transcription dans chaque type cellulaire. Les résultats ont permis de mettre en evidence des regions importantes pour l'activité transcriptionnelle alors qu'aucune interaction protéique n'y avait jusqu'alors été décrite. Ils ont permis l'identification de regions cibles d'un effet inhibiteur dans les cellules de carcinome embryonnaire et révélé que ces effets masquent des effets activateurs. Ceux-ci s'exercent de manière inattendue principalement via le site PEA1/AP1 dans les cellules F9.
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Dates and versions

tel-04497831 , version 1 (11-03-2024)

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  • HAL Id : tel-04497831 , version 1

Cite

Pascale Krejbich-Trotot. Activite transcriptionnelle aux stades precoces de l'embryogenese : etude systematique par mutagenese de la region regulatrice du virus polyome. Biologie moléculaire. Université Pierre et Marie Curie (Paris 6), 1993. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-04497831⟩
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