Contrôle de l'expression des gènes en biologie de synthèse: des plasmides à la reprogrammation de l'initiation de la traduction - Archive ouverte HAL Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2023

Taking the control in synthetic biology: from plasmids to reprogramming translation initiation

Contrôle de l'expression des gènes en biologie de synthèse: des plasmides à la reprogrammation de l'initiation de la traduction

Résumé

The Xenome team (UMR 8030 Genoscope) is developing an artificial genetic system based on the transmission of genetic information to bacteria via xenobiotic nucleic acids (XNA). These recombinant microorganisms are designed for industrial use and will not be capable of transmitting genetic information to native species. This PhD project centered on establishing a platform for cloning and conditional gene expression in E. coli. First, we constructed and characterized a series of standardized plasmids for the expression of gene(s) of interest. These plasmids are unable to recombine with E. coli’s chromosome since homology regions have been removed. Secondly, we introduced a system for the absolute control of translation, based on a modified initiator tRNA fmet/cys, which is required for protein synthesis. When applied to an essential gene, this technique permits biocontainment. Several approaches have been used to optimise the system’s performance and orthogonality, including the directed and targeted mutagenesis of the tRNA fmet/cys, the overexpression of cysteine-tRNA ligase and the expression and modification of heterologous translation components. Lastly, a plasmid curing strategy was developed using yeast meganuclease I-SCE1, allowing the removal of plasmids with its recognition site, which expands our toolkit for genetic modification. This novel approach enables the investigation of alternatives to critical enzyme activities that have not yet been replaced. Taken together, the technologies developed in this project allow for the exact expression of a gene of interest in E. coli and the biocontainment of genetically modified bacteria, paving the way for large-scale bioproduction in industrial settings.
L'équipe Xénome (UMR 8030 Genoscope) développe un système génétique artificiel basé sur la transmission d'informations génétiques à des bactéries via des acides nucléiques xénobiotiques (XNA). Ces micro-organismes recombinants, qui ne seront pas capables de transmettre l'information génétique aux espèces natives, sont destinés à un usage industriel. Ce projet de doctorat s'est concentré sur l'établissement d'une plateforme pour le clonage et l'expression conditionnelle de gènes chez E. coli. Dans un premier temps, nous avons construit et caractérisé une série de plasmides standardisés pour l'expression de gènes d'intérêt. Ces plasmides sont incapables de recombiner avec le chromosome d'E. coli puisque les régions d'homologie ont été supprimées. Nous avons, ensuite, introduit un système de contrôle absolu de la traduction, basé sur un ARNt initiateur modifié fmet/cys, qui est nécessaire à la synthèse des protéines. Appliquée à un gène essentiel, cette technique permet le bio-confinement. Plusieurs approches ont été utilisées pour optimiser les performances et l'orthogonalité du système, notamment la mutagenèse dirigée et ciblée de l'ARNt fmet/cys, la surexpression de la cystéine-ARNt ligase et l'expression et la modification de composants hétérologues de la traduction. Enfin, une stratégie de curage des plasmides a été développée à l'aide de la méganucléase de levure I-SCE1, permettant l'élimination des plasmides avec son site de reconnaissance, ce qui élargit notre boîte à outils pour la modification génétique. Cette nouvelle approche permet d'étudier des alternatives aux activités enzymatiques critiques qui n'ont pas encore été remplacées. L’ensemble des technologies développées dans ce projet permet l'expression exacte d'un gène d'intérêt chez E. coli et le bio-confinement de bactéries génétiquement modifiées, ouvrant ainsi la voie à une bio-production à grande échelle en milieu industriel.
Fichier non déposé

Dates et versions

tel-04409977 , version 1 (22-01-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04409977 , version 1

Citer

Humbeline Paupelin-Vaucelle,. Contrôle de l'expression des gènes en biologie de synthèse: des plasmides à la reprogrammation de l'initiation de la traduction. Sciences du Vivant [q-bio]. Université Paris - Saclay, 2023. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-04409977⟩
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