How to validate the RT-qPCR method in SybrGreen detection? Application to the analysis of the transcriptomic response of Campylobacter jejuni under stress
Comment valider la méthode de RT-qPCR en détection SybrGreen ? Application à l'analyse de la réponse transcriptomique de Campylobacter jejuni soumis à un stress
Résumé
The transcriptional analysis via the use of the RT-qPCR technique (Reverse Transcription coupled with quantitative PCR) is largely used even though the growing use of high flow sequencing techniques. The RT-qPCR allows to quantify the level of mensenger ARN of genes reflecting the level of expression of these genes. It has numerous applications that require a high caution when implementing it. This technique needs the validation of the different steps of the procedure and numerous tests need to be done before the experimentation as well as controls during the experimentation. The objective of this paper is to describe the different control points and to detail vigilance points to be respected during the use of the RT-qPCR. From the extraction of nuclear acids to final results analysis, the validation of the different steps has demonstrated a reliable and robust method for the publication of works about the transcriptomic response of bacterian pathogene Campylobacter jejuni submitted to thermal stress.
L’analyse transcriptionnelle via l’utilisation de la technique de RT-qPCR (Reverse Transcription couplée à la PCR quantitative) demeure largement utilisée malgré l’essor grandissant des techniques de séquençage haut débit. La RT-qPCR permet de quantifier le niveau des ARN messagers de gènes cibles reflétant ainsi le niveau d’expression de ces gènes. Elle a de nombreuses applications qui requièrent une forte exigence lors de sa mise au point. Cette technique nécessite la validation, une à une des différentes étapes de la procédure et de nombreux tests sont à effectuer en amont de l’expérimentation ainsi que des points de contrôle au cours de l’expérimentation. L’objectif de ce travail a été de décrire les différents points de contrôle et de détailler des points de vigilance à respecter lors de l’utilisation de la RT-qPCR. Depuis l’extraction des acides nucléiques jusqu’à l’analyse des résultats finaux, la validation des différentes étapes a démontré une méthode robuste et fiable pour la publication des travaux menés sur la réponse transcriptomique chez le pathogène bactérien Campylobacter jejuni soumis à un stress thermique.
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