Purification des protéines membranaires en microfluidique - Archive ouverte HAL Accéder directement au contenu
Communication Dans Un Congrès Année : 2023

Purification des protéines membranaires en microfluidique

Résumé

Le système nerveux central (SNC) est une cible thérapeutique pour de nombreux composés pharmacologiquement actifs. Pour atteindre leur cible, ces molécules doivent traverser la barrière hématoencéphalique (BHE). La BHE est une interface sélective entre le système sanguin (SS) et le SNC, dont le rôle est de maintenir l'homéostasie cérébrale. Ainsi, pour passer du SS au SNC ou inversement, les composés endogènes et exogènes doivent traverser les cellules endothéliales de la BHE. Ces cellules régulent la pénétration des molécules grâce à leurs transporteurs membranaires [1]. L’étude de l’expression de ces protéines est nécessaire pour comprendre leur implication dans l’administration, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de xénobiotiques. L'objectif de ce projet est de développer une méthode micro-préparative en microfluidique pour la purification de protéines membranaires à partir de cellules endothéliales. L'approche utilisée est la biotinylation des protéines de surface par la sulfo-NHS-SS-biotine et leur purification dans des puces microfluidiques à l'aide de billes magnétiques couplées à la streptavidine ou à la neutravidine, deux protéines ayant une très forte affinité pour la biotine (Kd = 1014-1015 mol.L-1) [2]. Les preuves de concept de la liaison de la sulfo-NHS-SS-biotine aux protéines membranaires et de la purification d’une protéine biotinylée présente dans un milieu complexe ont déjà été apportées [3]. Dans la continuité de ces résultats, une validation de la méthode de micropurification à partir de cellules boitnylées, par analyse LC-MS/MS, est en cours. Un modèle cellulaire de cellules endothéliales de la BHE est utilisé pour réaliser ces validations : la cellule hCMEC/D3 [4]. Ces cellules ont été biotinylées puis lysées et les protéines totales ont été dosées. 250 μg de protéines ont été introduits dans des puces de microfluidique en PMMA avec ou sans traitement de surface hydrophile. Pour purifier les protéines biotinylées, des billes magnétiques couplées à la streptavidine ou à la neutravidine ont préalablement été immobilisées dans le canal de la puce. Après les étapes de rinçage et d’élution, les fractions purifiées ont été analysées par LC-MS/MS. La purification microfluidique a été validée par la détermination du rendement des fractions membranaires purifiées par rapport au lysat cellulaire brut. Des comparaisons des purifications obtenues avec des puces traitées hydrophiles ou non, ainsi qu’avec des billes magnétiques couplées streptavidine ou neutravidine sont en cours de réalisation.

Domaines

Chimie
Fichier principal
Vignette du fichier
LECORGNE-LUCAS-vu AP(1).pdf (65.05 Ko) Télécharger le fichier
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)
Licence : CC BY NC - Paternité - Pas d'utilisation commerciale

Dates et versions

hal-04312576 , version 1 (30-11-2023)

Identifiants

  • HAL Id : hal-04312576 , version 1

Citer

Lucas Lecorgne, Meryam Taghi, Cerina Chhuon, Ida Chiara Guerrera, Gilles Phan, et al.. Purification des protéines membranaires en microfluidique. SEP23 - 15ème Congrès Francophone sur les Sciences Séparatives et les Couplages de l'AFSEP, Mar 2023, Paris, France. ⟨hal-04312576⟩
18 Consultations
12 Téléchargements

Partager

Gmail Facebook X LinkedIn More