Mise au point d’une méthode d’extraction de particules virales à partir de légumes fermentés à des fins d’analyse de métaviromes.
Résumé
Introduction
Les légumes fermentés abritent divers microorganismes, comme des levures, des bactéries lactiques et des protéobactéries. Leur développement se fait de manière séquentielle au cours de la fermentation, avec une première phase hétérofermentaire, généralement assurée par Leuconostoc mesenterioides, et une seconde homofermentaire, assurée par Lactiplantibacillus plantarum. Les bactériophages, qui sont des virus infectant des bactéries, pourrait jouer un rôle dans cette dynamique microbienne. Cependant la communauté virale des végétaux fermentés est peu décrite dans la littérature. L’objectif de ce travail est donc de la caractériser à l’aide des techniques actuelles de métagénomique virale. Pour cela, la mise au point d’une méthode d’extraction de la fraction virale à partir de légumes fermentés a été entreprise.
Méthodes
La procédure d’extraction de particules virales à partir de végétaux fermentés comprend 3 étapes : (i) dilution de la matrice dans du tampon salin afin de permettre le décrochage d’un maximum de particules virales, (ii) centrifugation et filtration pour retirer les cellules microbiennes puis (iii) précipitation au polyéthylène glycol (PEG) afin de concentrer la fraction virale extraite. Pour valider les différentes étapes de cette procédure, nous avons réalisé du spiking (= inoculation volontaire) dans des échantillons de choucroute à l’aide de phages de morphotypes différents (un podophage, un siphophage et un myophage). Ces phages ont été dénombrés à l’issue de la procédure d’extraction par la méthode en surcouche. Une fois la fraction virale extraite à partir du légume fermenté, une évaluation de la charge virale des échantillons est réalisée par microscopie à épifluorescence puis les acides nucléiques sont extraits des virus en vue d’être analysés par une approche de métagénomique virale.
Résultats
Les résultats montrent que la quantité d’échantillon et la porosité des filtres utilisés pour l’étape de filtration sont critiques pour permettre une bonne récupération des particules virales présentes dans l’échantillon. La filtration sur des filtres de porosité 0.22 μm engendre la perte massive des myophages et siphopages (3% et 2% de récupération, respectivement) mais pas celle des podophages (98% de récupération). L’utilisation de filtres de porosité 0.45 μm permet une meilleure récupération des particules virales, quel que soit le morphotype du phage considéré. L’utilisation de la procédure optimisée sur des échantillons de choucroute a permis d’estimer la charge virale à environ 108 particules par gramme dans ce système.
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