Apport des Nanoparticules d'alginate à la multifonction des peptides antimicrobiens, exemple de la bactériocine de classe IIb Entérocine DD14 - Archive ouverte HAL Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2020

Contribution of alginate nanoparticles to the multifunctionality of antimicrobial peptides: the example of the class IIb bacteriocin Enterocin DD14

Apport des Nanoparticules d'alginate à la multifonction des peptides antimicrobiens, exemple de la bactériocine de classe IIb Entérocine DD14

Résumé

In this thesis project, we evaluated the contribution of alginate nanoparticles to the multifunctionality of bacteriocins, in particular enterocin DD14 (EntDD14). This two-peptide bacteriocin, which has no leader sequence and therefore belongs to calsse IIb, has been characterized for its antibacterial activity against pathogenic germs such as Clostridium perfringens. The alginate nanoparticles (AlgNPs) we used were produced by physical grinding, using a ball mill (Retsch PM100), without chemical treatment. Once the AlgNPs had been prepared, the bacteriocin (EntDD14) was incorporated by physical adsorption onto their surface. The antibacterial activity against pathogenic strains of C. perfringens, isolated from chickens suffering from necrotic enteritis, was then tested. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the formulation, resulting from the adsorption of EntDD14 on AlgNPs, was reduced by a factor of 4, compared with that obtained with EntDD14 alone. It should be noted that the formulation developed in this thesis remains active under the physiological conditions of the human and chicken gastric tract reconstituted in vitro. We have also shown that EntDD14 alone, or bound to AlgNPs, shows no cellular cytotoxicity in human cell models of the Caco-2 and HT-29 cell lines after 24 hours of contact. Subsequently, the impact of EntDD14 alone and/or adsorbed on AlgNPs, at sub-inhibitory concentrations, on the expression levels of genes encoding toxin synthesis (α-toxin, -Like toxin, collagen adhesion protein and thiol-activated cytolysin) were determined. The expression levels of these genes were significantly reduced after treatment of the culture with EntDD14/AlgNPs formulations, but not by the addition of bacteriocin alone. The increase in bacteriocin activity by nanoparticles, the reduction in the expression of genes encoding the toxins involved in NE and the absence of cellular cytotoxicity thus demonstrate the viability of this type of formulation as a therapeutic alternative in the treatment of this pathology. To assess the contribution of alginate nanoparticles to the multifunctional capacities of EntDD14, we studied the impact of this molecule, alone or adsorbed on AlgNPs (at 1xCMI and 4xCMI), on the inflammatory response of Caco2 cells. We specifically targeted the interleukins IL-6 and IL-8, after induction of inflammation with lipopolysacharide (LPS) (50 µg / ml) from Escherichia coli.We observed a drastic reduction in IL-6 secretion, from 2.5 pg/ml to less than 0.5 pg/ml.With regard to IL-8, the effect of the various treatments was also clearly established, with a two- to three-fold reduction in the level of secretion of this interleukin compared with the untreated, inflamed control.We also studied the antiviral activity of free and AlgNPs-bound bacteriocin EntDD14.We evaluated this activity against herpesvirus (HSV-1), using Vero cells from African green monkey kidneys as a model, infected at a multiplicity of infection (MOI) of 0.07. These were then incubated in the presence of different concentrations of EntDD14 (7.5 to 150 µg/ml), and after 24 h of incubation, a significant drop in viral titer was observed for the highest concentrations (>30 µg/ml). This work has demonstrated the multifunctionality of enterocin DD14, and its relevance as an alternative or complement to antibiotic treatments in combination with nanoparticles in the context of necrotic enteritis.
Dans ce projet de thèse, nous avons évalué l’apport des nanoparticules d’alginate sur la multifonction des bactériocines, en particulier l’entérocine DD14 (EntDD14). Cette bactériocine à deux peptides sans séquence leader, appartenant donc à la calsse IIb, a été caractérisée pour son activité antibactérienne contre des germes pathogènes comme Clostridium perfringens. Les nanoparticules d’alginate (AlgNPs) que nous avons utilisé ont été produites par un broyage physique, en utilisant un broyeur à billes (Retsch PM100), sans traitement chimique. Une fois les AlgNPs préparées, la bactériocine (EntDD14) est incorporée par adsorption physique à leur surface. Des analyses permettant d’établir l’activité antibactérienne contre des souches pathogènes de C. perfringens, isolées de poulets atteints d’entérite nécrotique, ont ensuite été effectuées. Ainsi, la concentration inhibitrice minimale (CMI) de la formulation, résultant de l’adsorption de l’EntDD14 sur les AlgNPs, a été diminuée d’un facteur de 4, par rapport à celle obtenue avec EntDD14 seule. Il convient de noter que la formulation mise au point dans le cadre de cette thèse reste active dans les conditions physiologiques du tractus gastrique de l'homme et du poulet reconstituées in vitro. Par ailleurs, nous avons également montré que l’EntDD14 seule, ou fixée sur les AlgNPs, ne présente aucune cytotoxicité cellulaire sur les modèles de cellulles humaines apprtenant aux lignées Caco-2 et HT-29 après 24 heures de contact. Par la suite l’impact de l’EntDD14 seule et/ou adsorbée sur des AlgNPs, à des concentrations sub-inhibitrices, sur le niveau d'expression des gènes codant pour la synthèse des toxines (toxine α, -Like toxine, la protéine d'adhésion du collagène et la cytolysine activée par le thiol) ont été déterminées. Ainsi, les niveaux d’expression de ces gènes ont été considérablement dminués après traitement de la culture avec les formulations EntDD14/AlgNPs mais pas l’adjonction de la bactériocine seule. L’augmentation de l’activité de la bactériocine par les nanoparticules, la réduction de l’expression des gènes codant les toxines impliquées dans la NE et l’absence de cytotoxité cellulaire montrent ainsi la viabilité de ce type de formulation comme alternative thérapeutique dans le traitement de cette pathologie. Afin d’évaluer l’apport des nanoparticules d’alginate sur les capacités multifonctionnelles de l’EntDD14 nous avons étudié l’impact de cette molécule, seule ou adsorbée sur les AlgNPs (à 1xCMI et 4xCMI), sur la réponse inflammatoire des cellules Caco2. Nous avons ciblé particulièrement les interleukines IL-6 et IL-8, après induction de l’inflammation avec du lipopolysacharide (LPS) (50 µg / ml) provenant d’Escherichia coli. Ainsi nous avons pu observer une réduction drastique du niveau de sécrétion de l’IL-6, passant de 2,5 pg/ml à moins de 0,5 pg/ml. Concernant l'IL-8, l'effet des différents traitements est également clairement établi, avec une diminution du niveau de sécrétion de cette interleukine d'au moins deux à trois fois en comparaison avec le contrôle inflammé mais non traité. Nous avons également étudié l'activité antivirale de la bactériocine EntDD14 libre et fixée sur les AlgNPs. Nous avons évalué cette activité contre le virus de l’herpès (HSV-1), en utilisant comme modèle des cellules Vero, provenant de reins de singe vert d’Afrique, infectées à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,07. Celles-ci ont été incubées ensuite en présence de différentes concentrations d'EntDD14 (7,5 à 150 µg/ml) et après 24 h d'incubation, une baisse significative du titre viral a été observée pour les concentrations les plus élevées (>30 µg/ml). Ainsi ces travaux ont permis de mettre en évidence la multifonctionnalité de l’entérocine DD14 ainsi que sa pertinence comme alternative ou complément aux traitements antibiotiques en association avec les nanoparticules dans le contexte de l’entérite nécrotique.
Fichier non déposé

Dates et versions

tel-04549143 , version 1 (17-04-2024)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04549143 , version 1

Citer

Hassan Zgheib. Apport des Nanoparticules d'alginate à la multifonction des peptides antimicrobiens, exemple de la bactériocine de classe IIb Entérocine DD14. Chimie. Université de Lille, 2020. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-04549143⟩
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