Study of the radiosensitive period of the male gonad in rat and mouse fetus and newborn
Etude de la période radiosensible de la gonade mâle chez le fœtus et le nouveau-né de rat et de souris
Résumé
In rat fetuses, just after sexual differentiation, germ cells (gonocytes) actively proliferate. From 18 days post-conception (dpc), they stop in phase G1 of the cell cycle and only resume their mitoses from 4 days post-partum (dpp). From then on, they begin to differentiate into type A spermatogonia. The testis is known to be very sensitive to irradiation, particularly during the period of gonocyte quiescence. Indeed, in animals exposed to a dose of 1.5 Gy at 19 dpc, the gonocytes do not resume their mitoses and die by apoptosis without differentiating into spermatogonia, whereas if the irradiation is carried out at 15 dpc, when gonocytes divide actively, many seminiferous tubules are normal in adults.
The aim of this study was to investigate the causes of the particular radiosensitivity of cells
fetal and neonatal germ cells of rats.
We studied the expression of several genes involved in cell cycle arrest and apoptosis such as TP53, p21, TGFbeta, Bax, mdm2 and RB1, during testicular development of control and irradiated rats. The global DNA methylation status of gonocytes was also studied.
In the control rat testis, strong cytoplasmic expression of p53, p21, TGFbeta and Bax proteins was detected in gonocytes. p53 staining is only observed from 18 dpc, so during the mitotic rest phase of gonocytes. It then disappears in a proportion of them, at the same time as their restart in the cycle. Cytoplasmic staining of p21 and TGFbeta, colocalized with mitochondria, are observed in gonocytes before, during and after their blockage. No expression of mdm2 is detected, pRb is present only in gonocytes that resume their cycle, and Bax is expressed in both cycling and quiescent gonocytes. Using an antibody against 5-methyl cytosine, it was shown that gonocyte DNA shifted from a hypomethylated to a methylated status, 2 days after complete cessation of gonocyte mitoses.
In rats irradiated with a dose of 1.5 Gy at 19 dpc, the gonocytes do not resume their cycle and die by apoptosis from 6 dpp, i.d. 9 days after irradiation. At 12 dpp, the testes are irreversibly sterile. This apoptosis seems independent of p21, TGFbeta and Bax, because their expression is not modified compared to controls. While mdm2 expression and DNA methylation remain unchanged after irradiation, pRb and p53 expression are altered. No detection of pRb appears in gonocytes, and p53 is maintained until their death.
p53 appears to be an actor in the radiosensitivity of gonocytes, particularly in terms of maintaining cycle arrest and apoptosis. Its cytoplasmic accumulation could be linked to the absence of proteins involved in its degradation, such as mdm2. DNA methylation, which in general is representative of the inhibition of transcriptional activity of most genes, may be the cause of such a phenomenon.
This hypothesis of p53 stabilization is reinforced by the absence of effect of a treatment with actinomycin D or cycloheximide on its expression. However, although the expression of p53 is correlated with the arrest of the gonocyte cycle, we observed that these cells also presented a blocking phase in mice whose TP53 gene is invalidated, and that this blockage was maintained after irradiation. This suggests either that p53 does not regulate the gonocyte cycle or that p53 plays a redundant role in this process.
The p21 and TGFbeta proteins are likely not specifically involved in gonocyte cycle arrest. They appear rather as transient anti-apoptotic factors, associated with mitochondria.
This work provides new data relating to early testicular radiosensitivity in rodents. The unusual response of gonocytes to radiation-induced DNA damage is likely linked to the protection of the integrity of the germline genome.
Chez les fœtus de rat, juste après la différenciation sexuelle, les cellules germinales (gonocytes)
prolifèrent activement. À partir de 18 jours post-conception (jpc), ils s' arrêtent en phase G 1 du cycle cellulaire pour ne reprendre leurs mitoses qu' à partir de 4 jours post-partum (jpp). Dès lors, ils commencent à se différencier en spermatogonies de type A. Le testicule est connu comme étant très sensible à l'irradiation, en particulier durant la période de quiescence des gonocytes. En effet, chez l'animal exposé à une dose de 1,5 Gy à 19 jpc, les gonocytes ne reprennent pas leurs mitoses et meurent par apoptose sans se différencier en spermatogonies, alors que si l'irradiation est effectuée à 15 jpc, quand les gonocytes se divisent activement, beaucoup de tubes séminifères sont normaux chez l'adulte.
Le but de cette étude a été de rechercher les causes de la radiosensibilité particulière des cellules
germinales fœtales et néonatales de rats. Nous avons étudié l'expression de plusieurs gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose tels que TP53, p21wAFltcip\ TGFB_, Bax, mdm2 et RB1, au cours du développement testiculaire de rats témoins et irradiés. Le statut de méthylation globale de l'ADN des gonocytes a également été étudié.
Dans le testicule de rat témoin, une forte expression cytoplasmique des protéines p53, p21, TGFB et Bax a été détectée dans les gonocytes. Le marquage p53 n'est observé qu'à partir de 18 jpc, c'est-à-dire pendant la phase de repos mitotique des gonocytes. Il disparaît ensuite dans une proportion d'entre eux, en même temps que leur redémarrage dans le cycle. Les marquages cytoplasmiques de p21 et du TGFB, colocalisés avec les mitochondries, sont observés dans les gonocytes avant, pendant et après leur blocage. Aucune expression de mdm2 n' est détectée, pRb est présente seulement dans les gonocytes qui reprennent leur cycle, et Bax est exprimée à la fois dans les gonocytes cyclants et quiescents. À l'aide d'un anticorps dirigé contre la 5-méthyl cytosine, il a été montré que l'ADN des gonocytes passait d'un statut hypométhylé à un statut méthylé, 2 jours après l'arrêt complet des mitoses des gonocytes.
Chez le rat irradié avec une dose de 1,5 Gy à 19 jpc, les gonocytes ne reprennent pas leur cycle et meurent par apoptose à partir de 6 jpp, c'est-à-dire 9 jours après irradiation. À 12 jpp, les testicules sont irréversiblement stériles. Cette apoptose semble indépendante de p21, du TGFB et de Bax, car leur expression n'est pas modifiée comparativement aux témoins. Alors que l'expression de mdm2 et la méthylation de l'ADN restent inchangées après irradiation, l' expression de pRb et de p53 est modifiée. Aucune détection de pRb n'apparaît dans les gonocytes, et p53 est maintenue jusqu'à leur mort.
p53 apparaît comme un acteur de la radiosensibilité des gonocytes, particulièrement en terme de maintien de 1' arrêt du cycle et d' apoptose. Son accumulation cytoplasmique pourrait être liée à 1' absence de protéines impliquées dans sa dégradation, comme mdm2. La méthylation de l'ADN, qui en général est représentative de l'inhibition de l'activité transcriptionnelle de la plupart des gènes, peut être la cause d'un tel phénomène. Cette hypothèse d'une stabilisation de p53 est renforcée par l'absence d'effet d'un traitement par l' actinomycine D et la cycloheximide sur son expression. Toutefois, bien que l'expression de p53 soit corrélée avec l'arrêt du cycle des gonocytes, nous avons observé que ces cellules présentaient également une phase de blocage chez des souris dont le gène TP53 est invaiidé, et que ce blocage était maintenu après irradiation. Ceci suggère soit que p53 ne régule pas le cycle des gonocytes, soit que p53 joue un rôle redondant dans ce processus.
Les protéines p21 et TGFB ne sont vraisemblablement pas impliquées spécifiquement dans l'arrêt du cycle des gonocytes. Elles apparaissent plutôt comme des facteurs anti-apoptotiques transitoires, associés aux mitochondries.
Ce travail fournit de nouvelles données relatives à la radiosensibilité testiculaire précoce des rongeurs. La réponse inhabituelle des gonocytes vis-à-vis de dommages radio-induits de l'ADN est vraisemblablement liée à la protection de l'intégrité du génome de la lignée germinale.