Interplay between ABC membrane transporter BmrA and its membrane environment
Couplage entre BmrA un transporteur ABC membranaire et son environnement membranaire
Résumé
ABCs (ATP binding cassettes) transporters
constitute a large family of transmembrane proteins
present in all organisms. ABC transporters hydrolyze ATP
to translocate an immense quantity of amphiphilic
substrates, such as lipids, steroids, peptides... Some
ABCs confer a multiresistance cellular phenotype to drugs
from bacteria against antibiotics to humans against
anticancer agents, antivirals...
A fundamental question for understanding drug
transport at the molecular level is how the properties of
membranes modulate the function and spatial temporal
organization of ABCs. We studied in detail these coupling
with BmrA, a bacterial ABC of B. subtillis using different in
vitro membrane systems and different biochemical and
membrane biophysical approaches. Firstly, after
expression and purification of proteins in detergent, we
characterized the hydrolysis of ATP of BmrA according to
its membrane environment, solubilized in detergent
micelles and in mixed lipid/detergent micelles.
Proteoliposomes were characterized according to protein
orientation, incorporation rate, size and lamellarity. This
allowed us to modulate in a controlled manner lipid
composition, protein density and conformation and
membrane curvature to quantitatively determine the
respective contributions of these membrane parameters.
Thus, we show that ATP hydrolysis is sensitive to lipid
specificity when the protein is embedded in a bilayer. This
lipid specificity is provided by negative lipids and
phosphatidylethanolamine type lipids that synergistically
stimulate hydrolytic activity. However, ATP hydrolysis was
decreased in high positive membrane curvature. Secondly,
we determined the conditions of reconstitution of BmrA in
Giant Unilamellar Vesicles, which then allowed our
collaborator to study the respective roles of membrane
curvature and tension in the spatial organization of BmrA.
Nanotube pulling experiments performed in collaboration
show that BmrA has a strong preference for highly curved
membrane regions leading to protein cluster formation and
that this preference varies according to the catalytic state
of the protein. Finally, we developed a method to study the
dynamics of NBDs by Förster resonance energy transfer
at the single molecule level in reconstituted system via
fluorescence cross-correlation spectroscopy.
The data set suggest that spatial organizations
of ABC transporters in bacterial and eukaryotic cells are
different with the possibility of sorting during membrane
remodeling of eukaryotic membranes in areas of strong
membrane curvatures but without significant change in
function.
Les ABC (ATP binding cassettes) transporteurs
constituent une grande famille de protéine transmembranaire
présentent dans tous les organismes. Les ABC hydrolysent
l'ATP pour transporter une quantité immense de substrats
amphiphiles, comme les lipides, steroids, peptides...
Certains ABCs confèrent un phénotype cellulaire de
multiresistance aux drogues des bactéries contre les
antibiotiques à l’homme contre les agents anticancéreux,
antiviraux ...
Une question fondamentale pour comprendre le
transport de drogues est comment les propriétés de
membranes modulent la fonction et l’organisation spatio
temporelle des ABCs transporteurs. Nous avons étudié en
détails ces couplage avec BmrA, un ABC bactérien de B.
subtillis en utilisant différents systèmes membranaires in
vitro et différentes approches de biochimie et de biophysique
membranaire. Dans un premier temps, après expression et
purification des protéines en détergent, nous avons
caractérisé l’hydrolyse d’ATP en fonction de l’état de
l’environnement membranaire, solubilisé en micelle de
détergent et en micelles mixtes. Les proteoliposomes ont été
caractérisés en fonction de l’orientation des protéines, leur
taux d’incorporation, leur taille et la lamellarité. Cela nous a
permis de moduler de façon contrôlée la composition
lipidique, la densité et la conformation des protéines et la
courbure membranaire pour déterminer de façon quantitative
les contributions respectives de ces paramètres de
membranes. Ainsi, nous montrons que l’hydrolyse d’ATP est
sensible à la spécificité lipidique quand la protéine est dans
une bicouche et que les lipides négatifs et les lipides de type
phosphatidylethanolamine stimulent de façon synergique
l’activité hydrolytique. L’hydrolyse d’ATP diminue pour les
fortes courbure positives. Dans un second temps, nous
avons déterminé les conditions de reconstitution de BmrA
dans des vésicules géantes qui ont ensuite permis d’étudier
les rôles respectifs de la courbure et de la tensions
membranaire dans l’organisation spatiale de BmrA par des
approches de nanotube pulling. Les expériences en
collaboration montrent que BmrA a une préférence marquée
pour les régions membranaires à forte courbure conduisant à
la formation de cluster de protéines et que cette préférence
varie en fonction de l’état catalytique de la protéine.
Finalement, nous avons mis au point une méthode pour
étudier la dynamique des NBDs par transfert d'énergie de
résonance de Förster au niveau de la molécule unique dans
un système reconstitué par spectroscopie de fluorescence et
de corrélation croisée.
L’ensemble des données suggère que
organisations spatiales des ABC transporteurs dans les
cellules bactériennes et eucaryotes sont différentes avec la
possibilité de tris dans des zones de fortes courbures lors de
remodelages membranaires mais sans modification
importante de la fonction.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)