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Thèse Année : 2018

Interplay between ABC membrane transporter BmrA and its membrane environment

Couplage entre BmrA un transporteur ABC membranaire et son environnement membranaire

Résumé

ABCs (ATP binding cassettes) transporters constitute a large family of transmembrane proteins present in all organisms. ABC transporters hydrolyze ATP to translocate an immense quantity of amphiphilic substrates, such as lipids, steroids, peptides... Some ABCs confer a multiresistance cellular phenotype to drugs from bacteria against antibiotics to humans against anticancer agents, antivirals... A fundamental question for understanding drug transport at the molecular level is how the properties of membranes modulate the function and spatial temporal organization of ABCs. We studied in detail these coupling with BmrA, a bacterial ABC of B. subtillis using different in vitro membrane systems and different biochemical and membrane biophysical approaches. Firstly, after expression and purification of proteins in detergent, we characterized the hydrolysis of ATP of BmrA according to its membrane environment, solubilized in detergent micelles and in mixed lipid/detergent micelles. Proteoliposomes were characterized according to protein orientation, incorporation rate, size and lamellarity. This allowed us to modulate in a controlled manner lipid composition, protein density and conformation and membrane curvature to quantitatively determine the respective contributions of these membrane parameters. Thus, we show that ATP hydrolysis is sensitive to lipid specificity when the protein is embedded in a bilayer. This lipid specificity is provided by negative lipids and phosphatidylethanolamine type lipids that synergistically stimulate hydrolytic activity. However, ATP hydrolysis was decreased in high positive membrane curvature. Secondly, we determined the conditions of reconstitution of BmrA in Giant Unilamellar Vesicles, which then allowed our collaborator to study the respective roles of membrane curvature and tension in the spatial organization of BmrA. Nanotube pulling experiments performed in collaboration show that BmrA has a strong preference for highly curved membrane regions leading to protein cluster formation and that this preference varies according to the catalytic state of the protein. Finally, we developed a method to study the dynamics of NBDs by Förster resonance energy transfer at the single molecule level in reconstituted system via fluorescence cross-correlation spectroscopy. The data set suggest that spatial organizations of ABC transporters in bacterial and eukaryotic cells are different with the possibility of sorting during membrane remodeling of eukaryotic membranes in areas of strong membrane curvatures but without significant change in function.
Les ABC (ATP binding cassettes) transporteurs constituent une grande famille de protéine transmembranaire présentent dans tous les organismes. Les ABC hydrolysent l'ATP pour transporter une quantité immense de substrats amphiphiles, comme les lipides, steroids, peptides... Certains ABCs confèrent un phénotype cellulaire de multiresistance aux drogues des bactéries contre les antibiotiques à l’homme contre les agents anticancéreux, antiviraux ... Une question fondamentale pour comprendre le transport de drogues est comment les propriétés de membranes modulent la fonction et l’organisation spatio temporelle des ABCs transporteurs. Nous avons étudié en détails ces couplage avec BmrA, un ABC bactérien de B. subtillis en utilisant différents systèmes membranaires in vitro et différentes approches de biochimie et de biophysique membranaire. Dans un premier temps, après expression et purification des protéines en détergent, nous avons caractérisé l’hydrolyse d’ATP en fonction de l’état de l’environnement membranaire, solubilisé en micelle de détergent et en micelles mixtes. Les proteoliposomes ont été caractérisés en fonction de l’orientation des protéines, leur taux d’incorporation, leur taille et la lamellarité. Cela nous a permis de moduler de façon contrôlée la composition lipidique, la densité et la conformation des protéines et la courbure membranaire pour déterminer de façon quantitative les contributions respectives de ces paramètres de membranes. Ainsi, nous montrons que l’hydrolyse d’ATP est sensible à la spécificité lipidique quand la protéine est dans une bicouche et que les lipides négatifs et les lipides de type phosphatidylethanolamine stimulent de façon synergique l’activité hydrolytique. L’hydrolyse d’ATP diminue pour les fortes courbure positives. Dans un second temps, nous avons déterminé les conditions de reconstitution de BmrA dans des vésicules géantes qui ont ensuite permis d’étudier les rôles respectifs de la courbure et de la tensions membranaire dans l’organisation spatiale de BmrA par des approches de nanotube pulling. Les expériences en collaboration montrent que BmrA a une préférence marquée pour les régions membranaires à forte courbure conduisant à la formation de cluster de protéines et que cette préférence varie en fonction de l’état catalytique de la protéine. Finalement, nous avons mis au point une méthode pour étudier la dynamique des NBDs par transfert d'énergie de résonance de Förster au niveau de la molécule unique dans un système reconstitué par spectroscopie de fluorescence et de corrélation croisée. L’ensemble des données suggère que organisations spatiales des ABC transporteurs dans les cellules bactériennes et eucaryotes sont différentes avec la possibilité de tris dans des zones de fortes courbures lors de remodelages membranaires mais sans modification importante de la fonction.
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  • HAL Id : tel-04057000 , version 1

Citer

Su-Jin Paik. Interplay between ABC membrane transporter BmrA and its membrane environment. Life Sciences [q-bio]. Université de recherche Paris Sciences et Lettres PSL Research University, 2018. English. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-04057000⟩
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