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Thèse Année : 2022

Using micropatterned substrates to study the spatial organization of dorso-ventral identities within an in vitro model of spinal cord

Utilisation de substrats micropatternés pour l'étude de l'organisation spatiale des identités dorso-ventrales dans un modèle in vitro de tube neural

Résumé

During embryonic development, neural progenitors acquire distinct dorso-ventral identities in response to antiparallel gradients of BMP, Wnt and SHH along the neural tube. If classical models of this dorso-ventral patterning have provided clear evidence of the role of these morphogens, they are not suited for quantitative and time-trackable analysis of the cell response to those signals. In this thesis, we used a microfabrication technique to generate micropatterns of cell adherence which enabled us to differentiate cells in a spatially-controlled manner on a 2D plane, which allows us to overcome the issues presented previously. Micropatterned substrates have already been used to study signaling pathways involved in gastrulation or neuroectoderm patterning and to refine mechanisms that rule cell specification. We adapted protocols to differentiate human embryonic stem cells (hESCs) into neural progenitors for cell culture on micropatterns, and identified conditions to generate pure spinal neural progenitor populations from hESCs. I also studied the cell response in absence of exogenous stimulation and in presence of dorsalizing (BMP) or ventralizing signals (using an agonist of the SHH pathway, SAG). This study enabled us to show the implication of endogenous signaling pathways that tend to dorsalize cell identities in absence of exogenous stimulation, as well as to monitor the spatial organization of colonies submitted to different concentrations of BMP or SAG. We also investigated the molecular mechanisms that could explain how spatial organization emerges in the different conditions. For instance, our results suggest a role of the Activin/Nodal signalization pathway in ventral patterning, which remains to be fully understood. Finally, I began to study the differentiation of neural progenitors on other experimental devices that overcome some limits linked to micropatterned substrates and apply a basal stimulation, with the ultimate goal to apply a graded basal stimulation. I also tried to generate reporter cell lines that could be used for live imaging of neural progenitors. As a whole, this thesis is an exploratory work on how new cell culture techniques can be used to study dorso-ventral patterning of the neural tube, which could help decipher the involved mechanisms in a more controlled way.
Au cours du développement embryonnaire, les progéniteurs neuraux acquièrent des identités dorso-ventrales spécifiques en réponse à des gradients antiparallèles de BMP, Wnt et SHH au sein du tube neural. Si les modèles d'étude classiques de ce patterning dorso-ventral ont permis de mettre en évidence l'implication de ces morphogènes, ils ne permettent pas d'étudier la réponse cellulaire de manière quantitative et de suivre son évolution temporelle de manière optimale. Dans cette thèse, j'ai utilisé un procédé de microfabrication pour obtenir des micropatterns d'adhérence cellulaire permettant de différencier des cellules en 2D de manière spatialement contrôlée, ce qui permet de surmonter les limites présentées précédemment. Les substrats micropatternés ont déjà été utilisé pour étudier les voies de signalisation impliquées au cours de la gastrulation ou lors du patterning du neuroectoderme, et ont permis de préciser les mécanismes gouvernant la spécification cellulaire. J'ai donc adapté des protocoles de différenciation de cellules souches embryonnaires humaines (hESCs) en progéniteurs neuraux à la culture sur micropatterns, et j'ai identifié des conditions permettant d'obtenir des populations pures de progéniteurs spinaux caudaux à partir d'hESCs. J'ai également étudié la réponse des cellules en l'absence de stimulation exogène et en présence de signaux de dorsalisation (BMP) ou de ventralisation, en utilisant un agoniste de la voie SHH (SAG). Cette étude a permis de montrer l'implication de voies de signalisation endogènes qui tendent à dorsaliser les identités cellulaires en l'absence de stimulation exogène, ainsi que d'observer l'organisation spatiale de colonies soumises à différentes concentrations de BMP ou de SAG. Je me suis également intéressé aux mécanismes moléculaires pouvant expliquer l'émergence d'une organisation spatiale dans les différentes conditions étudiées. Les résultats suggèrent notamment un rôle de la voie de signalisation Activin/Nodal dans l'établissement d'un patterning ventral, qu'il reste encore à élucider. Finalement, j'ai commencé à étudier la différenciation de progéniteurs neuraux sur d'autres dispositifs pour pallier les limites liées aux substrats micropatternés, dans l'optique d'appliquer une stimulation basale, voire en forme de gradient. J'ai également tenté de générer des lignées cellulaires rapportrices propices à l'imagerie en temps réel de progéniteurs neuraux. Dans son ensemble, cette thèse a constitué un travail exploratoire autour de l'utilisation de nouvelles techniques de culture cellulaire pour l'étude du patterning dorso-ventral du tube neural, qui pourrait permettre de sonder les mécanismes impliqués de manière plus contrôlée.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04053398 , version 1 (31-03-2023)
tel-04053398 , version 2 (02-11-2023)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04053398 , version 2

Citer

Gabriel Thon. Using micropatterned substrates to study the spatial organization of dorso-ventral identities within an in vitro model of spinal cord. Physics [physics]. Université Paris Cité, 2022. English. ⟨NNT : 2022UNIP7124⟩. ⟨tel-04053398v2⟩
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