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Theses Year : 2021

Optimization of crystal growth of membrane proteins for advanced diffraction techniques

Optimisation de la croissance cristalline des protéines membranaires pour les techniques de diffraction avancées

Abstract

Membrane proteins are potential targets for drug design due to their vital biological functions. Investigating the 3D structure of proteins is essential to understand their function. Macromolecular X-ray crystallography is the most widely used technique to determine the structure of proteins. However, obtaining high diffraction quality crystals of membrane proteins, whilst maintaining their native conformation during the production, purification and crystallization steps, is challenging. Screening and optimization of crystallization conditions as well as finding optimal methods for growing high-quality crystals with appropriate size distribution is another bottleneck in modern structural studies of membrane proteins. Neutron protein crystallography requires crystals with a volume larger than 0.1 mm3, whereas micro- or nano-sized crystals are sufficient for Microcrystal Electron Diffraction (MicroED).Knowledge of the protein crystallization phase diagram allows the quality of the crystals to be controlled and subsequently optimized. Thanks to these tools, it is possible to adjust crucial physico-chemical parameters such as the temperature or the chemical composition of the crystallization solutions to optimize the crystallization process. Moreover, the automated control of these parameters has been achieved using a recently designed crystallization bench developed in our laboratory. Automated dialysis-based crystallization with variation of the temperature and composition of the crystallization solution by this instrument allows to screen different crystallization conditions using a single sample as well as to optimize the crystal growth in a reversible manner. Therefore, crystallization optimization and phase diagram exploration are possible using a small amount of protein. The crystallization of model soluble and membrane proteins has been demonstrated using this instrument to obtain crystals suitable for downstream structural studies by crystallography.This rational approach to crystallization was applied to the membrane proteins Acriflavine resistance protein B (AcrB) from Escherichia coli and TonB-dependent heme outer membrane transporter (ShuA) from Shigella dysenteriae. The purification of these proteins for crystallization was optimized. The purified proteins were then crystallized using different crystallization techniques, identifying the dialysis method as the most successful and consistent although comparable crystals were obtained with almost all techniques, but not always reproducible. AcrB crystals co-crystallized with rifampicin were used for systematic X-ray diffraction studies and the best statistics for the AcrB-rifampicin crystal from each method were compared. By co-crystallization of ShuA with europium (III) chloride, the 3D structure of this protein was solved at 2.49 Å. The results also showed that the purity of the protein sample and well-chosen additives improve the crystal quality.MicroED is an ideal method for studying membrane proteins and protein complexes that do not readily form crystals large enough for other diffraction techniques. The Coulomb potential maps determined by MicroED also provide information on the electrostatic environment and charge states of amino acids, which can complement the structural information obtained by other techniques. Preliminary studies applying this approach have been performed for our two model membrane proteins co-crystallized with additives.For further characterization of the crystallization process using the dialysis method, the mass transport of detergents across semi-permeable membranes was studied. This information, combined with previously determined knowledge of the diffusion of salts and polymeric precipitants across semi-permeable membranes, can be used to establish effective strategies for optimizing the crystallization of membrane proteins using this technique with automated control.
Les protéines membranaires sont des cibles potentielles pour la conception des médicaments en raison de leurs fonctions biologiques vitales. L'étude de la structure 3D des protéines est essentielle pour comprendre leur fonction. La cristallographie macromoléculaire aux rayons X est la technique la plus largement utilisée pour déterminer la structure des protéines. Cependant, obtenir des cristaux de protéines membranaires de haute qualité de diffraction, tout en maintenant leur conformation native pendant les étapes de production, de purification et de cristallisation, est un défi. Le criblage et l'optimisation des conditions de cristallisation ainsi que la recherche de méthodes optimales pour la croissance des cristaux de haute qualité, avec une distribution de taille appropriée, constituent un autre goulot d'étranglement dans les études structurales modernes des protéines membranaires.La connaissance du diagramme de phase de la cristallisation des protéines permet de contrôler la qualité des cristaux, puis de les optimiser. Grâce à ces outils, il est possible d'ajuster des paramètres physico-chimiques cruciaux tels que la température ou la composition chimique des solutions de cristallisation pour optimiser le processus de cristallisation. De plus, le contrôle automatisé de ces paramètres a été réalisé grâce à un banc de cristallisation récemment conçu dans notre laboratoire. La cristallisation automatisée par dialyse avec variation de la température et de la composition de la solution de cristallisation par cet instrument permet de cribler différentes conditions de cristallisation en utilisant un seul échantillon ainsi que d'optimiser la croissance des cristaux de manière réversible. Par conséquent, l'optimisation de la cristallisation et l'exploration du diagramme de phase sont possibles en utilisant une petite quantité de protéine. La cristallisation d'un modèle de protéine soluble et membranaire a été démontrée à l'aide de cet instrument afin d'obtenir des cristaux adaptés aux études structurales avancées par cristallographie.Cette approche rationnelle de la cristallisation a été appliquée aux protéines membranaires, AcrB et ShuA. La purification de ces protéines pour la cristallisation a été optimisée. Les protéines purifiées ont ensuite été cristallisées à l'aide des différentes techniques de cristallisation. La méthode de dialyse a été identifiée comme la plus réussie et la plus cohérente, bien que des cristaux comparables aient été obtenus avec presque toutes les techniques, mais pas toujours reproductibles. Des cristaux d'AcrB co-cristallisés avec de la rifampicine ont été utilisés pour des études systématiques de diffraction des rayons X et les meilleures statistiques pour le cristal d'AcrB-rifampicine de chaque méthode ont été comparées. Par la co-cristallisation de ShuA avec du chlorure d'europium (III), la structure 3D de cette protéine a été résolue à 2,49 Å. Les résultats ont également montré que la pureté de l'échantillon de protéine et des additifs bien choisis améliorent la qualité des cristaux.La MicroED est une méthode idéale pour étudier les protéines membranaires et les complexes protéiques qui ne forment pas facilement des cristaux suffisamment grands pour les autres techniques de diffraction. Des études préliminaires appliquant cette approche ont été réalisées pour nos deux protéines membranaires modèles co-cristallisées avec des additifs.Pour caractériser davantage le processus de cristallisation par la méthode de dialyse, le transport de masse des détergents à travers les membranes semi-perméables a été étudié. Ces informations, combinées aux connaissances précédemment déterminées sur la diffusion des sels et des polymères à travers les membranes semi-perméables, peuvent être utilisées pour établir des stratégies efficaces pour optimiser la cristallisation des protéines membranaires en utilisant cette technique avec un contrôle automatisé.
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Dates and versions

tel-03523192 , version 1 (12-01-2022)

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  • HAL Id : tel-03523192 , version 1

Cite

Elham Vahdatahar. Optimization of crystal growth of membrane proteins for advanced diffraction techniques. Biological Physics [physics.bio-ph]. Université Grenoble Alpes [2020-..], 2021. English. ⟨NNT : 2021GRALY040⟩. ⟨tel-03523192⟩
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