Cellular and molecular characterization of O. cf. ovata cell cycle - Archive ouverte HAL Access content directly
Theses Year : 2021

Cellular and molecular characterization of O. cf. ovata cell cycle

Caractérisation cellulaire et moléculaire du cycle cellulaire d’O. cf. ovata

Abstract

Dinoflagellates are protists with unique features among eukaryotes. The particular nucleus with chromosomes that remain condensed through the cell cycle and their unique kind of mitosis, called dinomitosis, set them apart from canonical eukaryotes and rise questions of how their cell cycle is controlled. Moreover, dinoflagellates are interesting from an ecological perspective, as they are the cause of massive and sometimes toxic proliferation events, called Harmful Algae Blooms (HABs). HABs are seasonal phenomena, which result mainly from an increase in cell division and aggregation through cell migration (Burkholder, et al., 2006). Ostreopsis cf. ovata is a cosmopolitan toxic dinoflagellate that produces seasonal blooms. Many ecological studies have addressed the parameters involved in the dynamic of Ostreopsis proliferation (Cohu, et al., 2011). However, it is currently unknown how this organism divides or how its cell cycle is controlled. The aim of this thesis was to provide a cellular and molecular characterization of the mitotic cell cycle, which underlies cell proliferation during vegetative growth, for the dinoflagellate O. cf. ovata. Morphological classification of cells collected at different phases of the bloom, allowed to identify different phases of the O. cf. ovata vegetative cycle, including cells undergoing division. Using this classification, I showed that during blooming, O. cf. ovata divides exclusively at night. Using immuno-fluorescence and confocal microscopy, I then characterized the changes in cytoskeletal organization associated with the O. cf. ovata cell cycle. During interphase, a ventral microtubule bundle protrudes from the ventral area, where the basal bodies are located, towards the nucleus and moves it to the center of the cell. Cells with a central nucleus are considered as pre-dividing. Once the nucleus is in the cell center, the mitotic spindle is organized perpendicularly to the long axis of the cell and segregates chromosomes to opposite cell ends. A cytokinetic plate made of microtubules starts to form in the dorsal area, opposite the basal bodies, already in anaphase. The cytokinetic plate grows unidirectionally towards the ventral side, dividing the cell along the longitudinal axis. To characterize O. cf. ovata cell cycle at the molecular level, I searched for O. cf. ovata homologues of conserved cell cycle regulators identified in model organisms, using a de novo transcriptome that I generated from cultured cells. This analysis revealed the presence of major components of the cell cycle such as cyclins and CDKs, proteins that are known to regulate mitotic entry, mitotic checkpoint components, kinetochore components and components of the budding yeast mitotic exit network. Cytokinetic and basal body components were also identified in the analysis. A differential expression analysis using meta-trascriptomic datasets corresponding to bloom samples enriched in interphase cells, pre-dividing cells and dividing, which I generated during the 2019 bloom, showed that more than 5000 transcripts were differentially expressed when comparing samples enriched in interphase cells and samples enriched in either pre-dividing or dividing cells. Among these transcripts, cyclin B, kinetochore and SAC components were up-regulated during the period of division. Instead, only 241 differentially expressed transcripts were present between pre-dividing or dividing cells. None of these transcripts was related with cell division, suggesting that once the cell is committed to mitosis (pre-dividing stage), the major regulations occur at the post-transcriptional level. By integrating the results obtained from the transcriptomic analysis with the cytological characterization I propose a first model of O. cf. ovata cell cycle, in which cyclins and CDK activities dictate the transition from interphase to mitosis.
Il y a 102 ans, Edouard Chatton soumit à l’Université de Paris, sa thèse intitulée “Peridiniens Parasites. Morphologie, Reproduction, Ethologie”. Il y décrivait les caractéristiques nucléaires du dinoflagellé Odinium Chatton. C’est sur la base de ses résultats que les dinoflagellés avaient été classées dans un groupe intermédiaire situé entre les procaryotes et les eucaryotes: les mésocaryotes . Aujourd’hui, il est reconnu que les dinoflagellés sont des eucaryotes qui présentent un cycle cellulaire canonique avec des phases G1, S, G2 et M. Néanmoins, leurs noyaux particuliers et leur mitose atypique appelée dinomitose les gardent à part des autres eucaryotes tandis que se pose la question de l’origine évolutive et moléculaire de ces structures et processus. D’un point de vue écologique, la prolifération des dinoflagellés peut présenter des phases tellement intenses que les toxines qu’elles produisent sont source de problèmes environnementaux : ces phases sont appelées efflorescences toxiques ou “Harmful Algae Blooms” (HABs) ou plus simplement “Blooms”. Les HABs sont des phénomènes saisonniers caractérisés par différentes phases définies par la concentration cellulaire. Dans des conditions environnementales optimales, les cellules végétatives originaires d’un inoculum formés de cystes subissent plusieurs cycles de division qui, avec la migration cellulaire, sont la cause principale de l’augmentation de biomasse observée pendant les blooms (phase proliférative). Ostreopsis cf. ovata est un dinoflagellé cosmopolite toxique qui produit des blooms saisonniers dont la fréquence et la distribution ont augmenté à travers le globe pendant ces vingt dernières années (Rhodes, 2011). Plusieurs études écologiques ont abordé les paramètres physiques impliqués dans la dynamique de prolifération d’Ostreopsis comme la température, la lumière, les nutriments, la turbulence, la salinité et les interactions allélochimiques mais également les relations biologiques. Cependant, la manière dont cet organisme se divise et comment sont contrôlés ses cycles cellulaires restent largement inconnus. Le but de mon travail de thèse a été de caractériser au niveau cellulaire et moléculaire le cycle cellulaire mitotique qui est à la base de la prolifération de O. cf. ovata durant la croissance végétative. Pour mes analyses, j’ai utilisé deux sources de cellules: des cellules “sauvages” collectées pendant les blooms estivaux dans la baie de Villefranche sur Mer et des cellules cultivées in vitro. J’ai utilisé une culture monoclonale, MCV054, qui a été obtenue à partir d’un bloom ayant eu lieu sur le même site en 2014. J’ai d’abord analysé le taux de croissance in vivo pendant trois blooms consécutifs (2018-2020) et dans la culture. J’ai montré que la souche MCV054 reprenait une dynamique similaire de croissance que le bloom ce qui suggère que les études concernant la prolifération pouvaient être effectuées sur cette souche. La morphologie des cellules collectées pendant les différentes phases du bloom permet d’identifier les différentes phases du cycle végétatif de O. cf. ovata incluant les cellules en division. En utilisant cette classification, j’ai montré que pendant le bloom O. cf. ovata se divisent exclusivement la nuit. La division cellulaire a été observée durant toutes les phases du bloom à des pourcentages variables, la phase proliférative étant caractérisée par 20-30% de cellules en division En raison de leurs très grands génomes, les approches génomiques et transcriptomiques qui sont de nos jours largement utilisées, n’ont été que très peu exploitées pour étudier la biologie des dinoflagellés. Pour caractériser le cycle cellulaire de O. cf. ovata au niveau moléculaire, j’ai décidé d’adopter une approche fondée sur l’exploration du génome entier et j’ai cherché des gènes homologues aux gènes régulateurs des cycles cellulaires “classiques”. J’ai généré un transcriptome de référence à partir de culture cellulaire et des jeux de données méta-transcriptomiques pour différentes étapes du bloom de 2019. J’ai utilisé le transcriptome de référence pour identifier chez O. cf. ovata les homologues des protéines connues pour être impliquées dans le cycle mitotique d’organismes modèles traditionnels: la levure Saccharomyces cerevisiae, l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii et le parasite apicomplexe Plasmodium falciparum. J’ai choisi une approche conservative et très utilisée, « reciprocal best hits », où deux gènes de deux génomes différents sont considérés homologues si leurs protéines sont les best hit l’une de l’autre dans le génome opposé. En utilisant cette approche, j’ai identifié des composants majeurs qui régulent le cycle cellulaire comme les cyclines et les CDKs, des protéines qui régulent l’entrée en mitose, des composants du checkpoint mitotique, des composants des kinetochores et des composants de la sortie de mitose de la levure. Des composants du corps basal et de la cytokinèse ont également été identifiés lors de cette analyse. Afin de déterminer si ces gènes sont régulés au niveau transcriptionnel pendant le cycle cellulaire de O. cf. ovata, j’ai réalisé une analyse d’expression différentielle (Kallisto pour quantifier l’abondance des transcrits et Sleuth in R-studio pour l’analyse exploratoire et l’analyse d’expression différentielle) en utilisant les jeux de données de méta-transcriptomique correspondant à des échantillons enrichis en cellules en interphase (milieu de la journée), cellules en pré-division (soir) et cellules en division (nuit) que j’ai généré lors du bloom 2019. Plus de 5000 transcrits exprimés différentiellement ont été identifiés en comparant les échantillons enrichis en cellules en interphase (jour) et les échantillons enrichis soit en cellules en pré-division (soir) soit en cellules en division (nuit). Parmi ces transcrits, j’ai retrouvé notamment la cycline B, des composants des kinétochores et des protéines du SAC. En revanche, seulement 241 transcrits exprimés différentiellement ont été trouvés entre les cellules en pré-division (soir) et les cellules en division (nuit). Aucun de ces transcrits n’est associé à la division cellulaire ce qui suggère qu’une fois que les cellules sont engagées dans la mitose (stade pré-division), les régulations majeures se font au niveau post-transcriptionnel. En parallèle, j’ai caractérisé les modifications de l’organisation du cytosquelette associées avec le cycle cellulaire mitotique d’O. cf. ovata en analysant des marquages immunofluorescents par microscopie confocale. Pendant l’interphase, un faisceau ventral de microtubules avance depuis la région du corps basal du côté ventral de la cellule vers le noyau. Le faisceau ventral s’allonge vers le noyau et le déplace au centre de la cellule en pré-division. Une fois que le noyau est au milieu de la cellule, «acentriolar spindle poles (kinetosomes) » organise le fuseau mitotique sans aster. Le fuseau mitotique est orienté perpendiculairement à l’axe long de la cellule et reste en contact avec la région ventrale grâce aux structures de microtubules appelées desmose qui sont originaires du faisceau ventral. Les chromosomes sont répartis par le fuseau de microtubules qui traverse le noyau alors qu’une plaque cytokinetique composée de microtubules commence à se former dans la région dorsale, à l’opposé des corps basaux. La plaque cytokinetique croît et divise la cellule le long de l’axe longitudinal. La division cellulaire génère deux cellules filles avec un noyau en position latérale. Le noyau sera de nouveau déplacé en région dorsale par le faisceau ventral ce qui marquera le début d’un nouveau cycle. Pendant la totalité du cycle, les microtubules corticales et le flagelle restent présents. La détection par anticorps spécifiques de formes de l’alpha-tubuline modifiées post-traductionnellement, soit tyrosinée soit acétylée ont permis de déterminer différentes sous-populations de microtubules. La tubuline acétylée marque préférentiellement le faisceau ventral, les desmoses et les pôles du fuseau alors que la tubuline tyrosinée marque le fuseau mitotique central. Ces différences montrent que la dinomitose est un processus dynamique durant lequel différentes sous-populations de microtubules effectuent des fonctions spécifiques: la tubuline tyrosinée marquent des structures transitoires utilisées pour séparer les chromosomes alors que la tubuline acétylée est retrouvée dans des microtubules plus durables utilisées pour déplacer le noyau. Le rôle des microtubules lors de la division cellulaire a été étudié partir de deux types de perturbations soit une exposition à la colchicine, une drogue qui dépolymérise les microtubules soit une exposition à une agitation du milieu. Des résultats préliminaires suggèrent que les microtubules ne sont pas requises pour le processus de division des cellules d’O. cf. ovata mais qu’elles sont nécessaires pour l’orientation correcte du plan de division. J’ai intégré l’ensemble de ces résultats dans un schéma global récapitulant les étapes du cycle cellulaire d’O. cf. ovata dans lequel l’activité des cyclines et des CDKs dicte la transition entre l’interphase et la mitose. J’ai émis l’hypothèse que les cellules avec un noyau situé au centre, que j’appelle “cellules en pré-division”, sont engagés dans la mitose car le fuseau mitotique se forme alors que le noyau est situé au milieu de la cellule, et des hauts niveaux de transcrits pour les cyclines mitotiques, les protéines du kinétochore et les composants du SAC sont déjà présents ou détectables dans les cellules en pré-division.
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Dates and versions

tel-03355199 , version 1 (27-09-2021)

Identifiers

  • HAL Id : tel-03355199 , version 1

Cite

David Velasquez. Cellular and molecular characterization of O. cf. ovata cell cycle. Life Sciences [q-bio]. Sorbonne Université, 2021. English. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-03355199⟩
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