Identification and characterization of the alginolytic system in the marine bacterium Zobellia galactanivorans
Identification et caractérisation du système alginolytique de la bactérie marine Zobellia galactanivorans
Abstract
The marine flavobacterium Zobellia galactanivorans is able to degrade a great variety of polysaccharides from macroalgae. I have focused on the degradation of alginate, the main cell wall polysaccharide from brown algae, which is widely used as gelling agent in industrial applications. The annotation of the genome of Z. galactanivorans has confirmed the huge capacity of this marine bacterium to degrade polysaccharides. Notably Z. galactanivorans possesses seven putative alginate lyases. These genes are organized into two clusters, together with other hypot hetical actors of alginate degradation (sugar kinase and dehydrogenases, a transcription factor, a SusCD-like system, etc.). I have shown that these gene clusters are transcribed within polycistronic mRNAs and thus form the first described alginolytic operons. After having evaluated reference genes for Z. galactanivorans, a targeted transcriptomic approach revealed that the expression the identified genes is strongly dependent on the presence of alginate. Comparative genomics and phylogenetic analyses showed that this pathway is partly conserved in other bacterial species, unraveling potential gene transfer events. The understanding of alginate utilization was broadened by a whole-genome expression profiling in Z. galactanivorans. It allowed the identification of other alginate-responsive genes that might participate in substrate perception, uptake or degradation. I conducted a medium-throughput cloning strategy including 21 target genes involved in alginate utilization. Two novel PL7 alginate lyases from Z. galactanivorans were then overexpressed in E. coli, purified and crystallized. Their specificity and mode of action have been investigated, leading to the identification of AlyA1 to be an endo-guluronate lyase and AlyA5 an exo-guluronate lyase. Both 3D structures were solved and gave insight into the determinants of substrate recognition and enzymatic properties. All results were integrated to propose a model for the alginolytic system in Z. galactanivorans.
La bactérie marine Zobellia galactanivorans dégrade un grand nombre de polysaccharides de macroalgues. Je me suis intéressé à la dégradation de l'alginate, un composé pariétal des algues brunes. L'annotation du génome a confirmé le potentiel de cette bactérie pour la dégradation de polysaccharides. Z. galactanivorans possède 7 alginate lyases putatives. Ces gènes sont organisés en deux clusters comprenant d'autres acteurs de la dégradation de l'alginate. J'ai montré que ces clusters sont transcrits au sein d'ARN polycistroniques et constituent des opérons alginolytiques. Une approche transcriptomique ciblée a révélé que l'expression des gènes identifiés dépend de la présence d'alginate. Des analyses de génomique comparative ont montré que cette voie métabolique est conservée chez d'autres bactéries, mettant en évidence des événements de transferts de gènes. La compréhension de l'utilisation de l'alginate a été élargie par un profilage transcriptomique à l'échelle du génome chez Z. galactanivorans. Il a permis d'identifier d'autres gènes répondant à la présence d'alginate et pouvant participer à la perception, la prise en charge ou la dégradation du substrat. J'ai entrepris une stratégie de clonage sur 21 gènes impliqués dans l'utilisation de l'alginate. Deux nouvelles alginate lyases PL7 de Z. galactanivorans ont ensuite été surexprimées chez E. coli, purifiées et cristallisées. Leur spécificité et mode d'action ont été étudiés, menant à l'identification d'AlyA1 comme endo-guluronate lyase et AlyA5 comme exo-guluronate lyase. Leurs structures 3D ont été résolues. Tous les résultats ont été intégrés pour proposer un modèle de système alginolytique chez Z. galactanivorans