New devices for the controlled application of nanosecond electrical pulses and the detection of their effects on cells : New findings and hypotheses on the parameters controlling the electropermeabilization of biological cells
Nouveaux dispositifs pour l'application contrôlée d'impulsions électriques nanosecondes et pour la détection de leurs effets sur les cellules : Nouveaux résultats et hypothèses sur les paramètres contrôlant l'électroperméabilisation des cellules biologiques
Résumé
New devices for the controlled application of nanosecond electrical pulses and the detection of their effects on cells. New findings and hypotheses on the parameters controlling the electropermeabilization of biological cells.Abstract:Manipulation of the membranes of cells in suspension or in tissues with electrical pulses is a major research topic in bio-electromagnetism. Until recently the effects of pulses of a few microseconds or milliseconds have mainly been studied. Such pulses only affect the cell plasma membrane. Pulses of a few nanoseconds with high field strength (of the order of a few MV /m) might lead to intracellular organelles manipulation. In addition, they represent a new tool to study the mechanisms of permeabilization.This thesis was mainly devoted to the effects of pulses of 10 ns on the plasma membrane. Experimental protocols to apply controlled and reproducible pulses on living objects have been defined. Measurement means (D-dot and B-dot) adapted to high voltages and high frequencies have been developed and implemented thus allowing for accurate and real-time monitoring of the pulses applied on the biological samples.Different approaches have been used to highlight the permeabilization of biological cells by pulses of 10 ns. The techniques used include the monitoring of bio-impedance in tissues and the internalization of non-permeant cytotoxic molecules in cells in suspension and in vivo in tumors. The conducted experiments allowed to demonstrate the high efficiency of low repetition rates in permeabilizing potato tissue. The influence of the conductivity of the extracellular medium on the efficiency of the permeabilization was also investigated. These experiments highlighted the important role played by the dynamic of the establishment and relaxation of the transmembrane potential difference.Finally a wide-field CARS microscope (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) was developed. It has been designed to study the effects of ultra-short pulses on biological cells at the molecular level. It already enables to obtain images of cells in 3 ns.
La manipulation des membranes des cellules en suspension ou dans des tissus au moyen d’impulsions électriques constitue un sujet de recherche majeur au cœur du bio-électromagnétisme. A ce jour les impulsions de quelques microsecondes voire millisecondes ont été principalement étudiées. Elles n’affectent que la membrane plasmique des cellules. Les impulsions nanosecondes de fort niveau de champ (de l’ordre de quelques MV/m) ouvrent la voie vers la manipulation des organelles intra-cellulaires. En outre, elles constituent un nouvel outil pour l’étude des mécanismes de la perméabilisation. Les travaux de cette thèse ont été principalement consacrés aux effets des impulsions de 10 ns sur la membrane plasmique. Des protocoles expérimentaux permettant d’appliquer de façon reproductible et contrôlée les impulsions sur des objets vivants ont été définis. Des moyens de mesure (D-dot et B-dot) adaptés aux hautes tensions et hautes fréquences ont été développés et mis en œuvre, permettant un contrôle en temps réel des impulsions délivrées.Différentes approches ont permis de mettre en évidence la perméabilisation des cellules par des impulsions de 10 ns. Ces techniques regroupent notamment le suivi de bio-impédance dans les tissus et l’internalisation de molécules cytotoxiques non perméantes dans des cellules en suspension et in vivo sur des tumeurs. Les expériences conduites ont permis de mettre en évidence la plus grande efficacité des basses fréquences de répétition dans la perméabilisation d’un tissu végétal (la pomme de terre). De plus l’influence de la conductivité du milieu extracellulaire sur le niveau de perméabilisation a été investiguée. Ces expériences ont permis de mettre en évidence l’importance de la dynamique d’établissement et de relaxation de la différence de potentiel transmembranaire dans l’efficacité de la perméabilisation.Enfin un microscope CARS (Coherent Anti-stokes Raman Scattering) plein-champ a été développé. Sa conception a été pensée en vue de l’étude des effets des impulsions ultra-courtes sur le vivant à l’échelle moléculaire. A ce jour il permet d’obtenir des images de cellules en CARS en 3 ns.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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