Introduction et objectifs : Clostridioides difficile (C. difficile) est un pathogène nosocomial majeur responsable de près d’un demi-million d’infections digestives et de 25 000 décès chaque année aux États-Unis. L’infection à C. difficile (ICD) survient après une antibiothérapie qui induit une dysbiose du microbiote intestinal. Dans ce contexte de dysbiose, les spores de C. difficile acquises par l’environnement vont germer ; les formes végétatives vont pouvoir se multiplier dans le tractus digestif et produire les toxines TcdA et TcdB. L’action de ces deux toxines va provoquer une altération du cytosquelette et conduire au recrutement de nombreux neutrophiles favorisant ainsi le processus inflammatoire et conduisant aux manifestations cliniques d’ICD. L’étude des toxines est donc une étape cruciale dans le suivi de la virulence de ce pathogène. Actuellement, le processus de purification des toxines natives est soit laborieux chez C. difficile, soit réalisé chez des hôtes hétérologues (ex : Bacillus megaterium). Nous proposons donc une nouvelle méthode permettant de produire rapidement des toxines purifiées et fonctionnelles à partir d’une souche de C. difficile. Résultats et discussion : La construction des souches permettant la production des toxines recombinantes rTcdA et rTcdB a été réalisée en deux étapes. La première consiste à ajouter une étiquette histidine en C-terminal des gènes tcdA ou tcdB d’une souche de C. difficile 630Δerm par méthode d’échange allélique. Ces souches ont ensuite été utilisées pour générer deux nouvelles souches en remplaçant par le même procédé le promoteur respectif des toxines A et B par le promoteur Ptet inductible à l’anhydro-tétracycline (ATc). A l’aide de ces souches, les protéines rTcdA et rTcdB peuvent être produites après induction à la tétracycline anhydre et purifiées sur résine de Nickel. Nous avons vérifié que cette nouvelle méthode permet d’obtenir des toxines fonctionnelles par observation d’une activité cytopathogène sur des tapis confluents de cellules VERO. Nous avons également validé leur utilisation en tant qu’antigène dans des tests ELISA quantitatif pondéral. Conclusion Ce nouveau protocole permet de produire rapidement et en quantité suffisante les deux toxines TcdA et TcdB tout en conservant leur activité. Il simplifie ainsi l’accès à cette ressource précieuse jusque-là difficile à produire.