Les bactéries croissent en formant des colonies dans les aliments fermentés, comme dans les fromages où les bactéries lactiques sont immobilisées lors de la coagulation du lait. Pour mieux comprendre la physiologie et le métabolisme bactérien in situ, nous avons développé des approches novatrices, à l’échelle microscopique, pour explorer les interactions entre la colonie bactérienne et la matrice. Nous avons utilisé un fromage modèle ensemencé en une souche de Lactococcus lactis, pour lequel nous avons caractérisé la distribution spatiale des colonies, i.e. leur nombre et leur taille, et ses conséquences sur les réactions pendant le processus d’affinage, notamment la protéolyse. Nous avons également déterminé quel était le micro-environnement de la colonie bactérienne en termes de pH et de diffusion des solutés dans la matrice et dans les colonies. La distribution spatiale des colonies a été quantifiée pour la première fois dans un fromage modèle. La même population finale est obtenue quelle que soit la population initiale, mais la distribution diffère : plus la population initiale est faible, plus les colonies sont grosses et distantes, et vice-versa, à population initiale élevée, les colonies sont petites et proches. Pour deux distributions spatiales de la même population de L. lactis sous forme de petites ou de grosses colonies (3.107 petites colonies/g de 4 µm de rayon ou 2.105 grosses colonies de 25 µm de rayon), le taux de croissance, la vitesse d’acidification et la survie de L. lactis étaient les mêmes. La distribution spatiale des colonies de L. lactis n’influençait que de façon modérée la cinétique d’affinage, avec notamment une accélération de la protéolyse pour la population distribuée en petites colonies. Concernant le micro-environnement, aucun micro-gradient de pH n’est observé autour des colonies de L. lactis, quelle que soit leur taille dans la gamme couverte et ii) des solutés de très haute masse moléculaire (dextrans jusqu’à 2000 kDa) diffusent dans les matrices fromagères et les colonies bactériennes. Par contre, la diffusion de protéines laitières est ralentie dans les matrices fromagères en raison de leur rigidité et leur charge, et elles ne diffusent pas dans les colonies. Ces résultats suggèrent que le métabolisme des colonies dans le fromage se rapproche de celui des bactéries en culture planctonique, alors que la plupart des travaux étudiant les colonies, majoritairement conduits sur des « macro-colonies » de rayon supérieur à 200 µm, montrent un changement de métabolisme et la détection de micro-gradients de pH dans et autour des colonies.