Responses of the diatom Phaeodactylum tricornutum to nitrogen starvation followed by a resupply : dynamics of neutral lipid production and degradation in ecotypes Pt1 and Pt4
Réponses de la diatomée Phaeodactylum tricornutum à une carence azotée suivie d’une resupplémentation : dynamique de formation et de dégradation des lipides neutres chez les écotypes Pt1 et Pt4
Résumé
Diatoms are microalgae of great ecological relevance. As a response to variations in their environment, such as a nitrogen deficiency, they reorient their metabolism towards the accumulation of triglycerides (TG) that are stored inside lipid droplets (LD). The variation in their biomass composition as a response to abiotic stress has caught attention for their commercial use. However, stress also induces an arrest in growth which limits the productivity of these approaches. To increase this productivity, most research have focused on enhancing lipid synthetic pathways. Yet, some studies have also demonstrated that inactivation of degradation pathways was a promising approach, although, in diatoms, these pathways are poorly described. Most studies focusing on diatom lipid metabolism have used the model Phaeodactylum tricornutum. This species comprises various ecotypes, isolated all around the world, including the frequently studied and genetically distant Pt1 and Pt4. Previous reports have also emphasized that these ecotypes displayed different lipid accumulation phenotypes. The main aims of this PhD thesis were therefore to characterize on the one hand the responses of these two ecotypes during a nitrogen starvation that induces lipid accumulation, and, on the other hand to gain a better understanding of the lipid degradation processes that take place after resupply of starved cultures. The cultures were characterized using several approaches. Confocal microscopy showed that total LD volume increased while plastid volume decreased under starvation, with an inverse and faster response after resupply, supporting the recycling of plastid elements during starvation. The two ecotypes showed different accumulation strategies, highlighting phenotypic differences also detected through photosynthetic physiology and cell volume analyses. However, 24 hours after resupplying nitrogen, both ecotypes experience similar dynamics of LD fragmentation before returning to a situation close to the nitrogen replete state within 72 hours. Focusing on fragmentation, a change in the localization of specific LDs was observed, suggesting a movement away from the plastid, possibly indicating the action of lipophagy, one of the two known lipid degradation mechanisms in eukaryotes along with lipolysis. Biochemical analyses have refined these observations, revealing that, in addition to lipid dynamics, a variation in soluble carbohydrates that are rapidly accumulated under starvation and consumed as early as 12 hours after nitrogen resupply. The expression of genes involved in lipid and carbohydrate metabolism was also measured, highlighting certain isoforms that are particularly regulated by the transition between starvation and resupply. Some genes were regulated differently between Pt1 and Pt4, supporting their differential phenotypic response. To select target genes involved in lipid degradation, a bioinformatic screening was carried out, allowing the identification of 8 candidate lipases. Analysis of the regulation of the corresponding transcripts showed that one of them (Phatr3_EG02408) was overexpressed in both ecotypes after resupplying nitrogen, highlighting its possible role in this response. A functional study of this enzyme shall be conducted, coupled to a study of the relative importance of lipolysis and lipophagy.
Les diatomées sont des microalgues qui présentent une grande importance écologique. En réponse à des variations dans leur environnement, comme une carence en azote, elles réorientent leur métabolisme vers l'accumulation de triglycérides (TG) qui sont stockés dans des gouttelettes lipidiques (LD). La variation de composition de leur biomasse en réponse à des stress abiotiques a attiré l'attention pour leur valorisation économique. Cependant, les stress induisent également un arrêt de croissance ce qui limite la productivité de ces approches. Pour augmenter cette productivité, la plupart des recherches se sont concentrées sur l'augmentation des voies de synthèse des lipides. Toutefois, certaines études ont également démontré que l'inactivation des voies de dégradation était une approche prometteuse, bien que chez les diatomées, ces voies soient mal connues. La plupart des recherches centrées sur le métabolisme des lipides des diatomées ont étudié le modèle Phaeodactylum tricornutum. Cette espèce comporte différents écotypes, isolés à différents endroits du globe, dont notamment les écotypes Pt1 et Pt4 fréquemment étudiés et génétiquement distants. De précédentes études ont en outre souligné que ces écotypes présentaient des phénotypes différents d'accumulation des lipides. Les objectifs principaux de cette thèse ont donc été d'une part de caractériser les réponses de ces deux écotypes pendant une carence azotée qui induit l'accumulation de lipides, et d'autre part d'obtenir une meilleure compréhension des processus de dégradation des lipides mis en place après resupplémentation des cultures carencées. Les cultures ont été caractérisées via plusieurs approches. La microscopie confocale a montré que le volume total des LD augmentait tandis que le volume du plaste diminuait en carence, avec une réponse inverse et plus rapide après resupplémentation, soutenant le recyclage d'éléments du plaste pendant la carence. Les deux écotypes ont montré des stratégies d'accumulation différentes, soulignant des différences phénotypiques également détectées au niveau de la physiologie photosynthétique et du volume cellulaire. Toutefois, 24 heures après retour de l'azote, les deux écotypes montrent une dynamique similaire de fragmentation des LDs avant de retourner à une situation proche de l'état non carencé en 72 heures. En se concentrant sur la fragmentation, un changement de localisation de certaines LDs a été observé, ce qui suggère un éloignement par rapport au plaste, pouvant signifier l'implication de la lipophagie, l'un des deux mécanismes de dégradation des lipides connus chez les eucaryotes avec la lipolyse. Les analyses de biochimie ont affiné ces observations avec la mise en évidence, en plus de la dynamique des lipides, d'une dynamique des glucides solubles qui sont rapidement accumulés en carence et consommés dès 12 heures après retour de l'azote. Une mesure de l'expression des gènes impliqués dans le métabolisme des lipides et des glucides a été conduite mettant en évidence certaines isoformes particulièrement régulées par la transition entre carence et resupplémentation. Certains gènes étaient régulés de manière différente entre Pt1 et Pt4, soulignant leurs différences de réponse phénotypique. Pour pouvoir choisir les gènes à étudier concernant la dégradation des lipides, un criblage bioinformatique a été conduit permettant d'identifier 8 lipases candidates. L'analyse de la régulation des transcrits correspondants a montré que l'une d'entre elles (Phatr3_EG02408) était surexprimée chez les deux écotypes après retour de l'azote soulignant son possible rôle dans cette réponse. Une étude fonctionnelle de cette enzyme pourra être couplée à une étude de l'importance relative de la lipolyse et de la lipophagie.
Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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