La métalloenzyme multimérique membranaire NADPH oxydase du neutrophile (NOX2), est impliquée dans plusieurs fonctions physiologiques vitales incluant la réponse immunitaire, en contribuant fortement à la destruction des pathogènes ou autres envahisseurs du corps humain. Les fonctions physiologiques de NOX2 sont assurées par sa fonction chimique de catalyseur de la production d’anions superoxyde via la réduction monoélectronique du dioxygène à une face de la membrane, simultanément à l’oxydation biélectronique du NADPH à l’autre face de la membrane. L’étude des caractéristiques biochimiques de l’enzyme entière, incluant ses mécanismes d’activation et de régulation, en lien avec l’assemblage macromoléculaire, est réalisée in vitro en utilisant des fractions membranaires de neutrophile (FM), petites vésicules contenant NOX2, ainsi que les protéines cytosoliques recombinantes (p67phox, p47phox et Rac1/2) indispensables à sa fonction, en présence d’une molécule activatrice comme l’acide arachidonique (AA), un acide gras. La technique historiquement privilégiée de mesure de l’activité enzymatique de NOX2 implique la détection des anions superoxyde par une sonde protéique, le Cytochrome c (Cytc). Dans ce système, les anions superoxyde, dont la production est catalysée par NOX2 vers l’intérieur des vésicules de FM, sont détectés à l’extérieur. En corrélation avec la littérature, ces recherches montrent que l’activité enzymatique déterminée via la détection des anions superoxyde par le Cytc est plus faible que lorsqu’elle est déterminée via la mesure de la consommation du NADPH. L’origine du problème inclut potentiellement des contraintes de perméabilité membranaire, de structure de la membrane et des protéines, d’interactions des protéines entre-elles et avec les lipides membranaires, de pertinence de la sonde utilisée et de réactions secondaires. Ces hypothèses ont été testées par différents moyens incluant notamment des mesures de cinétiques globales et de l’activité de NOX2 dans différentes conditions et avec différentes observables (NADPH, Cytc, dioxygène), en présence de détergent ou d’ionophore, en faisant varier la température de mesure, la concentration en Cytc, la concentration en substrat, la concentration en AA ou le temps de préincubation. La présence de réactions secondaires a également été testée par électrochimie. Cette étude montre que la mesure de la production des anions superoxyde est limitée par la perméabilité membranaire et par les réactions secondaires. Il a aussi été mis en exergue que la concentration en Cytc usuelle pour ces mesures n’est pas saturante et de façon inattendue que les FM catalysent intrinsèquement la dismutation du peroxyde d’hydrogène à l’aide d’un composant thermolabile. Il est aujourd’hui très compliqué de mesurer de façon concomitante l’activité de la NADPH oxydase et son assemblage. Le deuxième objectif de cette thèse était donc la mise au point de vésicules géantes unilamellaires (GUV) intégrant NOX2 dans leur membrane, ce qui permettrait d’observer par microscopie de fluorescence l’assemblage du complexe NADPH oxydase et de simultanément mesurer la production des anions superoxyde par électrochimie sous microscope. La formation de GUV possédant des FM (FM-GUV) à leur membrane est un succès mais sans confirmation de l’intégration de NOX2 à la membrane des GUV. L’assemblage des protéines cytosoliques à la face externe de la membrane a été étudié sur GUV et sur FM-GUV, ce qui a permis de montrer que l’ancrage membranaire de ces protéines est possible seulement en présence d’AA et dû de façon prépondérante aux lipides et que NOX2 joue un rôle minoritaire. L’étude des interactions entre les protéines cytosoliques et la face interne de la membrane des GUV reste à optimiser. Il a été possible de détecter en GUV qualitativement une activité de NOX2 par électrochimie et par fluorescence (Amplex-Red), mais ce point reste aussi à optimiser.